Metileno urdina G6PD laborategiko probetan: zer egiten duen benetan koloratzaileak

Ikasle batek bi hodi behatzen ditu inkubazioaren ondoren. Batek espero zen kolorea hartu du. Besteak ez. Ikasleak ondorioztatzen du bigarren pazienteak glukosa-6-fosfato deshidrogenasaren gabezia duela. Ondorio hori zuzena izan daiteke, baina arrazoibideak probaren funtzionamendua azaltzen duen kontzeptua alde batera uzten du. Hodian ez da entzima zuzenean neurtzen. Entzimak ekoizten duena neurtzen da, metileno urdina bitartekari gisa erabiliz.

Zeharkako neurketa hori argi dagoenean, prozedurak, kontrolek eta emaitza faltsuen zerrenda luzeak ez dute jada arbitrarioak ematen.

Erantzun laburra

G6PD probetan, metileno urdina erredox-adierazlea da. G6PD entzimak NADPH sortzen du, eta NADPHaren mendeko sistemek metileno urdin urdina haren leuko forma kolorge bihurtzen dute erredukzioz, edo elektroiak garraiatzeko erabiltzen dute. Entzima-jarduera normalak erredukzio eraginkorra eragiten du. Jarduera eskasak erredukzio motela edo osatugabea eragiten du. Hori da seinale osoa.

Bi metodo historikok koloratzaile bera erabiltzen dute, baina amaierako adierazlea desberdina da. Bereizi biak, eta nahaste gehienak desagertuko dira.

Bi proba, koloratzaile bat, amaierako adierazle desberdinak

Lehena metileno urdinaren zuzeneko erredukzio-proba da, Sassek eta lankideek deskribatua eta gero Gibbsek ebaluatua. Hemen, amaierako adierazlea koloratzailea bera da: metileno urdin oxidatu urdina leucometileno urdin kolorge bihurtzen da erredukzioz, eta aldaketa horren abiadurak NADPH sortzeko ahalmena islatzen du. Baheketari buruzko jatorrizko artikulua PubMed-en dago indexatuta, Sass et al. (1966) erreferentziarekin.

Bigarrena Brewer-en metahemoglobinaren erredukzio-proba da. Sodio nitritoak hemoglobina metahemoglobina marroi bihurtzen du lehenik, oxidazioz. Ondoren, metileno urdinak elektroi-transferentziaren bitartekari gisa jarduten du: metileno urdin erreduzituak baliokide erreduzitzaileak ematen dizkio metahemoglobinari, berriz hemoglobina gorri bihurtuz. Beraz, amaierako adierazle ikusgarria marroiaren eta gorriaren arteko aldea da, ez urdinaren eta kolorgearen artekoa. Jatorrizko metodoa Osasunaren Mundu Erakundearen buletinean argitaratu zen (Brewer et al., 1960).

Brewer saiakuntzari koloratzailearen dekolorazio-proba deitzea ez da zehatza kimikaren ikuspegitik. Koloratzaileak zikloa errepikatzen du; hemoglobinak aldatzen du kolorea. Beheko diagramak bi bideak erakusten ditu.

Oinarrian dagoen erreakzioa

G6PDk pentosa fosfatoen bidearen lehen urrats oxidatiboa katalizatzen du:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Globulu gorri helduek bide horren mendekotasun handia dute NADPH lortzeko, Luzzattok eta lankideek Blood aldizkarian (2020) berrikusi zutenez. NADPHak glutationa erreduzituta mantentzen du, eta zelula kalte oxidatibotik babesten du. Metileno urdinak sistema horretan parte hartzen du, elektroi-hartzaile gisa. G6PD nahikoa izateak NADPH nahikoa izatea dakar, eta horrek erredukzio eraginkorra ahalbidetzen du. G6PD maila baxuak katea lehen katebegian hausten du.

Pentsa koloratzailea erregai-mailaren adierazlea dela, ez motorra. NADPH horniduraren berri ematen du. Hornidura hori edo irakurketa aldatzen duen beste edozein faktorek orratza mugiaraz dezake, genean inolako aldaketarik egon gabe.

Nola egiten den Brewer motako prozedura

Erreaktiboen formulazioak aldatu egin dira hamarkadetan zehar; beraz, irakaskuntzarako deskribapen bat ez da protokolo klinikotzat hartu behar. Laborategi bakoitzak bere lan-prozedura estandar baliozkotua jarraitzen du. Ohar hori kontuan hartuta, hodi bidezko antolaketa klasikoak honela funtzionatzen du, argitaratutako aplikazio honetan hiru hodirekin eta 3 orduko inkubazioarekin dokumentatutako moduan:

1. Pazientearen hodia: odol osoa gehi glukosa, sodio nitritoa eta metileno urdina. Nitritoak metahemoglobina sortzen du, glukosak globulu gorrien metabolismoa elikatzen du, eta koloratzaileak NADPHaren mendeko elektroi-garraioa ahalbidetzen du.
2. Kontrol oxidatua: odola gehi nitritoa eta glukosa, baina metileno urdinik gabe. Metahemoglobinaren amaierako kolore marroia erakusten du, gabeziaren patroia.
3. Hemoglobinaren kontrola: odola gehi ura. Hemoglobinaren amaierako kolore gorria erakusten du, patroi normala.
4. Inkubatu hodi guztiak 37 C inguruan, normalean 3 orduz, leunki nahastuz.
5. Diluitu hodi bakoitzeko alikuota txiki bat ur destilatuan, zelulak lisatzeko eta koloreak alderatu ahal izateko.
6. Alderatu pazientearen hodia bi kontrolekin. Gorrirantz itzultzeak ahalmen erreduzitzaile nabarmena adierazten du. Marroi mantentzeak gabezia nabarmena iradokitzen du.

Formulazio historiko batek 1 mL odol inguru erabiltzen zuen, sodio nitritoa 180 mM inguruan, dextrosa 280 mM inguruan eta metileno urdina 0.4 mM inguruan zuten erreaktiboekin. Hartu zenbaki horiek literaturako adibide gisa, ez zehaztapen unibertsal gisa.

Emaitza interpretatzea

Baheketa kualitatiboak hobekien bereizten du jarduera normalaren ehuneko 30 eta 40 arteko mailaren inguruan, G6PD detekzioaren hutsuneei buruzko Malaria Journal aldizkariko berrikuspen honetan azaltzen denez. Beraz, baheketa-emaitza normalak esan nahi du saiakuntzak ez duela gabezia larririk detektatu. Ez du ziurtatzen jarduera erabat normala denik.

Zergatik izan daitekeen baheketa engainagarria

Hemolisiaren ondorengo erretikulozitosia da emaitza faltsuki normalaren kasu klasikoa. Globulu gorri gazteek eta erretikulozitoek zelula zaharrek baino G6PD gehiago dute. Gertakari hemolitiko akutu batean, baliteke zelula zaharrenak eta gabezia handiena dutenak jada suntsituta egotea, eta probetan jarduera normala erakusten duen populazio gazte bat geratzea. Fenomeno biologiko berak saiakuntza kuantitatiboak ere engainatzen ditu, ez soilik koloratzaile bidezko baheketak.

Duela gutxiko transfusioak gabezia ezkutatzen du, emailearen globulu gorriek beren entzima ekartzen baitute laginera. Mayo Clinic Laboratories-ek transfusioa aipatzen du entzima-emaitza fidagaitzen arrazoien artean, erretikulozitosiarekin eta leukozitoen interferentziarekin batera.

Emakume heterozigotoak dira kasurik zailena. X kromosomaren ausazko inaktibazioak globulu gorri normalen eta gabezia dutenen nahasketa sortzen du, eta jarduera orokorra edozein mailatan egon daiteke, gabezia larritik hasi eta itxuraz normalera arte. Baheketa kualitatiboek sarritan ez dituzte tarteko fenotipoak detektatzen. WHOren G6PD probei buruzko dokumentazioak xehe azaltzen du muga hori.

Laginaren adinak, biltegiratze-tenperaturak, amaierako adierazlearen ikusizko ebaluazioaren subjektibotasunak, hematokritoak eta erreaktiboen kalitateak zarata analitikoa gehitzen diete eragin biologiko horiei.

Baheketa ez da diagnostikoa

Gabezia adierazten duen, tartekoa den edo egoera klinikoarekin bat ez datorren baheketa-emaitzak G6PD entzimaren saiakuntza kuantitatiboa eskatzen du. WHOk tenperatura kontrolatuko espektrofotometria kuantitatiboa hartzen du erreferentziazko metodotzat. Saiakuntza horretan, globulu gorrien hemolisatu bati glukosa-6-fosfatoa eta NADP+ gehitzen zaizkio, eta sortutako NADPHaren jarraipena egiten da 340 nm-ko absorbantziaren igoera neurtuz. Aldaketaren abiadura entzima-jarduerarekiko proportzionala da; normalean, hemoglobinarekiko normalizatzen da, gramoko unitatetan adieraziz. Egungo laborategi klinikoetako jardunbidea Mayo-ren proba-katalogoko G6PD jarduerari buruzko sarreran laburbiltzen da.

Interpretazioak laborategiak baliozkotutako erreferentzia-tartea erabiltzen du, askotan populazioaren jarduera normalarekiko adierazia; gabezia ehuneko 30eko atalasearen inguruan kokatzen da maiz, eta tarteko jarduera haren gainetik. WHOren G6PD probetarako produktu-helburuen profilek (2022) diagnostiko-esparru hori zehazten dute. Duela gutxiko hemolisiak edo transfusioak fenotipoaren ebaluazioa fidagaitz egiten badu, errepikatu proba globulu gorrien populazioa berriz orekatu ondoren; proba molekularrek informazio gehigarria eman dezakete, baina ez dute entzimaren neurketa ordezten.

Mantentzea merezi duen bereizketa

Saiakuntza hauetan, metileno urdina ex vivo laborategiko erreaktiboa da. Gai hori eta paziente bati metileno urdina ematearen segurtasuna bereizita aztertu behar dira; azken hori metileno urdinaren kontraindikazioei buruzko gidan lantzen da. Biokimikak lotzen ditu, sendagaia ere NADPHaren mendeko erredukzioaren mende baitago, baina saiakuntza-hodi bateko koloratzailea ez da odol-zirkulazioko dosi bat. Beste testuinguru batean koloratzaileak tindatzaile gisa nola jokatzen duen ulertzeko, ikus metileno urdinarekin tindatzeko oinarriak; eta zer familia kimikotakoa den jakiteko, laborategiko erredox-koloratzaileak.

Baheketak ahalmen erreduzitzailea osorik dagoela dirudien galdetzen du. Berrespenak benetan zenbat entzima dagoen galdetzen du. Koloratzaileak ondo erantzuten dio lehen galderari, betiere inork bigarrenari erantzuteko eskatzen ez badio.