Metileno urdina DNA eta RNA tindatzeko: geletako eta mintzetako aplikazioak

Ikasle batek agarosa-gel baten elektroforesia egiten du, metileno urdinarekin tindatzen du, eta ez du ezer ikusten banda distiratsu bat espero zuen tokian. Ondoko lanpostuan, doktoretza ondoko ikertzaile batek Northern mintz bat tindatzen du botila urdin berarekin, eta hiru minutuan banda erribosomiko garbiak lortzen ditu. Ikasleak ondorioztatzen du gelak huts egin duela. Gelak ez du huts egin. Bi zereginak desberdinak ziren, eta tindagai berak sentikortasun, hondoko kolore eta ondorengo urratsetarako arau desberdinekin erantzuten die.

DNA metileno urdinarekin tindatzeak eta RNA metileno urdinarekin tindatzeak kimika bera dute, baina ez helburu bera. Gel batean, tindagaiak matrize porotsu baten barruan zenbat azido nukleiko dagoen adierazten du. Mintz batean, transferentzia ondo egin den eta erreietan kantitate berdintsuak kargatu diren adierazten du. Bereizketa hori argi dagoenean, protokoloak, detekzio-mugak eta bateragarritasun-mugak ulertzea errazagoa da.

Erantzun laburra

Metileno urdina tindagai katioiko laua da, eta azido nukleikoei modu ez-kobalentean eta itzulgarrian lotzen zaie, fosfatoarekiko erakarpen elektrostatikoaren, base-bikoteen arteko interkalazioaren eta ildo txikiaren loturaren konbinazio baten bidez. Itzulgarritasun hori da gakoa. Bandak tindatu eta argi ikusgaiarekin ikus daitezke, dokumentatu, eta gero tindagaia kendu edo lagina garbitu, klonatzeko, hibridatzeko edo berriro zundatzeko.

Agarosa-geletako harizpi bikoitzeko DNA metileno urdinarekin tindatzeko, errezeta azkar estandarra uretan ehuneko 0.02 w/v da (200 mikrogramo mL-ko), gutxi gorabehera 15 minutuko tindaketarekin eta beste 15 minutu inguruz urarekin tindagaia kentzearekin; argi zuriko kutxa batean behatzen da. Mintzetarako, Northern bloteko errezeta klasikoa ehuneko 0.02 eta 0.04 arteko tindagaia da, pH 5.2 inguruko sodio azetatoan: transferentziaren eta immobilizazioaren ondoren hainbat minutuz tindatu, gero urarekin pasatu eta tindagaia erabat kendu hibridatu aurretik. Sentikortasuna apala da: hamarnaka eta ehunka nanogramo artean gel-banda bakoitzeko baldintza onetan, eta gida kontserbadoreek 0.5 eta 1 mikrogramo artean adierazten dute. Hori etidio bromuroaren eta SYBR tindagaien mugak baino magnitude-ordena batzuk handiagoa da. Mintzetan ez dago transkripto bakarrerako detekzio-muga erabilgarri bakar bat, tindaketak batez ere RNA erribosomiko ugaria eta kargatutako material guztia erakusten baititu. Ez erabili txikizkako osagarri-disoluzio bat bi errezeta horietako batean ordezko gisa. Baliozkotutako metodoek kalitate analitikoko tindagaia, zehaztutako tanpoiak eta, RNA dagoenean, RNasarik gabeko manipulazioa eskatzen dituzte.

Loturak nola funtzionatzen duen, eta non nahas gaitzakeen

Eredu erabilgarriak hiru atal ditu. Lehenik, karga positiboko eraztun-sistema karga negatiboko fosfato-eskeletoak erakartzen du. Ikerketa espektroskopikoek osagai elektrostatiko hori nagusi dela aurkitu dute gatz-kontzentrazio txikietan; modelizazioak eta dinamika molekularrak, berriz, interkalazioa eta ildo txikiko lotura harizpi bikoitzeko DNArako modu egonkortzat mantentzen dituzte, metileno urdinaren eta DNAren arteko loturari buruzko ikerketa espektroskopiko batean laburbiltzen denez. Bigarrenik, GCrekiko nolabaiteko lehentasuna dago: modelizazioak CpG eta GpC urratsak hobesten ditu, eta esperimentuek GC ugariko duplexekiko lehentasunezko lotura jakinarazten dute metileno urdinaren interkalazio-lehentasunei buruzko lanean; hala ere, AT duplexak ere lotzen dira. Ohiko tindaketa ez da sekuentzia espezifiko batena. Hirugarrenik, harizpi bakarreko DNA eta RNA batez ere elkarrekintza elektrostatikoen bidez eta eskuragarri dauden baseekin eta duplex-eskualdeekin pilatuz lotzen dira; horregatik, tindaketaren intentsitatea luzeraren, sekuentziaren eta egitura sekundarioaren arabera aldatzen da.

Horrek bi ondorio ditu. Lotura ez-kobalentea denez, tindagaia garbiketarekin kentzen da. Poliakrilamidako bandak azkar lausotzen dira nahita finkatzen ez badira, eta finkapen iraunkorrerako aldaera espezifiko bat dago, hain zuzen, tindaketa arrunta aldi baterakoa delako, Sotok eta Draperrek PAGE geletarako deskribatzen duten bezala. Tindagaia fotosentsibilizatzailea denez, oxigenoaren presentzian tindatutako DNA denbora luzez argi biziarekin argiztatzeak guanina oxida dezake eta, azkenean, harizpietan ebakiak eragin; mekanismo hori metileno urdinak sentsibilizatutako guaninaren oxidazioari buruzko lanean zehazten da. Argi zuriarekin labur behatzeak etidio bromuroaren ohiko prozeduretan ezaguna den UV kaltea saihesten du, eta abantaila hori benetakoa da prestaketa-helburuko berreskurapenerako. Argi ikusgaia leunagoa da, ez kalterik gabea. Laburtu argiztapena DNA klonatuko bada. Kontu horren atzean dagoen fotokimika zabalagoa ezagutzeko, ikus metileno urdinaren fotokimikako bi bideak. Forma oxidatua zergatik lotzen den eta forma erreduzitua zergatik ez azaltzen duten erredox bikotea eta karga-egoerak ezagutzeko, ikus metileno urdinaren egituraren eta propietateen kimika.

Lehen zeregina: gelen barruan tindatzea

Gelak tindatzeak galdera bati erantzuten dio: banda honetan begi hutsez ikusteko adina azido nukleiko al dago? Agarosan dagoen harizpi bikoitzeko DNA da ondoen ezagutzen den kasua. Flores eta lankideen metileno urdinarekin gelak tindatzeko jatorrizko metodoak ehuneko 0.02ko protokolo azkarra baliozkotu zuen ehuneko 1eko agarosan, eta ondoren berreskurapena eta klonazioa arrakastatsuak izan zirela erakutsi zuen. Hornitzailearen protokolo bera IBI Scientific-en metileno urdinaren produktu-orrian ageri da; bertan, mintzetarako ehuneko 0.04ko errezeta eta geletarako aldaera azkarra elkarren ondoan zerrendatzen dira.

Lan-prozedura praktikoa:

1. Egin gelaren elektroforesia ohi bezala. Tindatu elektroforesiaren ondoren, ez bitartean, salbu eta metodo aldatu baterako transferentzia edo bereizmena baliozkotu bada.
2. Murgildu ur destilatuan prestatutako ehuneko 0.02 w/v metileno urdinean, astiro astinduz, 15 minutu inguruz.
3. Kendu tindagaia ura hainbat aldiz aldatuz, guztira 15 minutu inguruz, matrizearen hondoko kolorea apaldu eta bandak nabarmendu arte.
4. Atera argazkia berehala, argi zuriko argiztagailu batean.

Agarosak eta poliakrilamidak portaera desberdina dute. Agarosak tindagaia matrizean atxikitzen du; beraz, tindagaia kentzea da urrats motela. Poliakrilamida-gel meheak azkar tindatzen dira, baina tindagaia ere azkar galtzen dute; horrek lagundu egiten du bandak prestaketa-helburuz mozten, baina erregistroak artxibatzea zailtzen du. Poliakrilamidako oligonukleotido sintetikoak ehuneko 0.02ko errezeta berarekin aurki daitezke 20 eta 30 minutu artean, urarekin behin eta berriz garbituz, Current Protocols estiloko PAGE metodo finkatuei jarraituta. TBE diluituan ehuneko 0.0002 inguruko aldaera oso diluituak ere deskribatu dira oligonukleotidoen prestaketarako, hainbat orduko prozesuekin, baina ebidentzia-oinarria ahulagoa da.

DNA ala RNA izateak garrantzia du. Harizpi bikoitzeko DNAk egituratutako loturarik sendoena ematen du. RNA eta harizpi bakarreko DNA tindatzen dira, baina ahulago eta aurreikusteko zailago. Formaldehidodun agarosa-geletako RNArako, laborategi gehienek ez dute gel barruko tindaketa urdina egiten: RNA mintz batera eramaten dute lehenik, eta han tindatzen dute. Aldaketa horrek gelaren seinale ahula mintzeko seinale garbiago batekin eta kargaren erregistro batekin ordezkatzen du.

Bigarren zeregina: mintzetan tindatzea

Mintzak tindatzeak beste galdera bati erantzuten dio: transferentzia ondo egin al da, eta erreiak alderagarriak al dira? Aplikazio klasikoa Herrin eta Schmidten Northern bloteko tindaketa itzulgarria da: jatorriz, ehuneko 0.04ko tindagaia 50 mM sodio azetatoan, pH 5.0n, 2 eta 3 minutu artean, ondoren urarekin pasatuta; hibridatu aurretik, SSPEtan prestatutako SDS diluituarekin ken daiteke.

Gaur egun asko erabiltzen den aldaera honela egiten da:

1. Transferitu RNA edo DNA desnaturalizatua nylonera edo nitrozelulosara; gero, immobilizatu UV bidezko lotura gurutzatuekin edo bero-tratamenduarekin, tindatzean lagina ez galtzeko.
2. Aukerakoa baina ohikoa: busti mintza ehuneko 5eko azido azetikoan 15 minutu inguruz.
3. Tindatu 5 eta 10 minutu artean ehuneko 0.02 eta 0.04 arteko metileno urdinarekin, 0.3 eta 0.5 M arteko sodio azetatoan, pH 5.2 inguruan.
4. Pasatu urarekin eta kendu tindagaia uretan 5 eta 15 minutu artean, dokumentatu, eta gero kendu hondar-tindagaia hibridatu aurretik.

Karga positiboko nylona nagusi da Northern lanetan. Nitrozelulosak ere balio du azido azetikoa eta azetatoa erabiltzen dituen prozedura berarekin. Irudia transferentzia baieztatzeko, 28S eta 18S bandak alderatzeko (edo 23S eta 16S, bakterioen RNA bada), tamaina-markatzaileak eta estandarrak markatzeko, eta RNA totalaren normalizazio-erregistro orientagarri bat gordetzeko erabiltzen da. Argitaratutako Northern metodoek tindatutako banda erribosomikoak kuantifikatzen dituzte karga egiaztatzeko; horien artean daude metileno urdinarekin tindatutako banda erribosomikoak normalizaziorako erabili zituzten esnekien zientziako lanak. Southern mintzak modu berean ikus daitezke, baina tindagaia askoz finkatuago dago Northern analisietan karga eta transferentzia egiaztatzeko; gainera, Southern analisiko DNA transferitu aurretik desnaturalizatzen da, eta, beraz, geletako sentikortasun-balioak ezin dira zuzenean aplikatu.

Detekzio-mugak eta hondoko kolorea: non galtzen duen urdinak

Ondoko alderaketa nahita da gutxi gorabeherakoa. Tindaketaren errendimendua gelaren ehunekoaren, bandaren zabaleraren, optikaren eta tindagaia kentzean izandako arretaren araberakoa da. Hartu zenbaki bakoitza magnitude-ordena gisa, ez zehaztapen gisa.

Hondoko kolorearen kontrolak erabakitzen du seinale apala erabilgarria den ala ez. Tindagai askeak kolore bizia du; beraz, kontrastea lortzeko lotu gabeko tindagaia kendu behar da, lotutakoa kendu gabe. Tindagai kontzentratuagoak gutxitan handitzen du sentikortasuna. Batez ere tindagaia kentzeko denbora luzatzen du. Probatu diluzio-serie bat erabiliko dituzun gel, mintz eta kamera berberekin, eta erabili dentsitate integratua sartutako kantitatearekiko proportzionala den tartea soilik. Metileno urdinak kargaren normalizazio semikuantitatiboa ahalbidetzen du. Ez da tarte dinamiko handiko saiakuntza kuantitatiboa, mintzaren ahalmena, transferentzia-eraginkortasuna, saturazioa eta tindagaia kentzea errei batetik bestera aldatzen baitira.

Bateragarritasun-mugak: zer mantentzen den tindaketaren ondoren

Tindaketa urdinaren ondoren klonatzea frogatuta dago. Floresek eta lankideek tindatutako agarosa-bandak moztu zituzten, DNA berreskuratu, ligatu eta transformazioan erabili zuten, eta etidio bromuroarekin eta UVrekin baino klonazio hobea jakinarazi zuten. Arrazoi probablea fotokalte txikiagoa da, ez tindagaiaren berezko onura bat. Mantendu argi zuriarekiko esposizioa labur, eta garbitu berreskuratutako DNA geletik erauzteko ohiko prozedura batekin.

PCRrako eta sekuentziaziorako ebidentzia urriagoa da. Hondar-tindagaia azido nukleikoei lotzen zaie; beraz, kendu tindagaia eta garbitu lagina urrats entzimatikoen aurretik. Gel urdin batetik behar bezala purifikatutako DNAk funtzionatzea espero da, baina polimerasa eta sekuentziazio-kimika desberdinek zuzenean arrastatutako tindagaia zenbateraino onartzen duten ez dago ondo kuantifikatuta. Ez hartu ziurtzat.

Blot hibridazioa bateragarria da ordena zorrotz mantentzen denean: transferitu, immobilizatu, tindatu, dokumentatu, tindagaia kendu, hibridatu. Sekuentzia hori da Herrin eta Schmidten diseinua. Transferitu aurretik tindatzea edo tindagaia kendu gabe uztea beste metodo bat da, eta berezko baliozkotzea behar du. Tindagaia kendu ondoren, zundak kentzeko eta berriro zundatzeko prozedura estandarrak ohi bezala egiten dira. Tindagai-familia berarekin zelulak tindatzeari buruz, eta prestakin finkatuen logika zergatik ezin den zelula bizien metodoetara eraman jakiteko, ikus mikroskopiako tindaketen atlasa.

Bandak mozteak balio du prestaketa-helburuko agarosarako eta urdinarekin aurkitutako PAGEko oligonukleotidoetarako, betiere finkapen iraunkorreko aldaera saihesten bada. Tindagaia kendu ondorengo elektroeluzioa kimikoki arrazoizkoa da lotura itzulgarria duen tindagai baterako, baina metileno urdinari buruzko errendimendu-datu kontrolatuak urriak dira. Eluzioaren ondoren, kendu gatzak edo prezipitatu.

Behin eta berriz gertatzen diren hutsak

Gel-banda ahulek normalean esan nahi dute masa txikiegia dagoela tindaketa kolorimetriko baterako, bereziki harizpi bakarreko xede laburretan edo RNA xedeetan. Kargatu gehiago, erabili tindagai freskoa, luzatu tindaketa kontzentrazioa handitu aurretik, eta utzi tindagaia kentzeari lehenago. Kontrasterik gabeko gel guztiz urdin batek normalean gehiegizko tindaketa edo ur-aldaketa gutxiegi adierazten ditu. PAGE bandak lausotzea espero izatekoa da kimikaren ondorioz, ez tindaketaren porrota. Atera argazkia azkar. Mintzeko hondoko kolore irregularrak tolesturak, burbuilak, hatz-markak, astintze irregularra edo transferentzia zatikakoa adieraz ditzake. Ez interpretatu hori karga desberdin gisa hibridazio-kontrolik gabe. Eredu erribosomiko ahul eta lausotu batek degradazioa adieraz dezake, baina baita transferentzia osatugabea, RNA total gutxiegi ere (ohiko erreiek hainbat mikrogramotik hamarnaka mikrogramora bitarteko kantitateak izaten dituzte), edo tindagaia gehiegi kentzea. Tindagaiak RNA erribosomiko ugaria erakusten du. Ez du transkripto espezifiko bat erakusten. Lan hori zundari dagokio.

Segurtasuna eta manipulazioa, gehiegizko baieztapenik gabe

Metileno urdina etidio bromuroa baino errazago manipulatzen da, baina ez da kaltegabea. MilliporeSigma-ren egungo segurtasun-datuen fitxa batek tindagaia aho bidezko toxikotasun akutuko 4. kategorian sailkatzen du, irentsiz gero kaltegarria dela adierazten du, eta hondakinak baimendutako bide baten bidez ezabatzea eskatzen du, Sigma-Aldrich-en metileno urdinaren segurtasun-datuen fitxaren arabera. Etidio bromuroak genotoxikotasunari buruzko ohartarazpen zorrotzagoak ditu, besteak beste zelula germinaletan izan ditzakeen ondorio susmagarriak, haren Sigma-Aldrich-en etidio bromuroaren segurtasun-datuen fitxan jasotzen denez; haren gelak eta disoluzioak hondakin kimiko arriskutsu gisa bereizi ohi dira, Thermo Fisher-en azido nukleikoen tindagaien gidan adierazten den bezala. Jarraitu bi produktuen segurtasun-datuen fitxei eta erakundearen arauei. Mantendu tindagai lehorra ondo itxita eta lehor, berrerabili laneko tindagai-disoluzioa protokoloak baimentzen duen neurrian soilik, gorde tindatutako mintzak lehor iragazki-orrien artean, eta atera gelei argazkia bandak difusioz desagertu aurretik.

Gogoratu laborategiko lan-mahairako esaldia. Gelek karga handiko ikusgarritasuna probatzen dute argi zuriarekin. Mintzek transferentzia eta karga probatzen dituzte zundak lan sentikorra egin aurretik. Tindagai bakarrak bietarako balio du, sentikortasun apalarekin, lotura itzulgarriarekin eta urratsen ordena zorrotzarekin.