E. coli eta beste kolonien itxura irakurtzea EMB agarrean

Ikasle batek lagin ezezagun bat ereiten du ildaskatze bidez eosina eta metileno-urdina dituen agarrean, gau osoan inkubatzen du, eta hurrengo egunean distira berdea duten kolonia ilunez betetako plaka aurkitzen du. Koadernoko oharrean hau idazten du: "E. coli, berretsita". Ohar horrek plakak justifika dezakeena baino gehiago baieztatzen du. Plakak hazkuntza- eta hartzidura-fenotipo bat erakusten du baldintza jakin batzuetan. Espeziearen identitatea beste baieztapen bat da, eta bestelako frogak behar ditu.

Gida honek interpretazio-lan gisa lantzen ditu EMB agarraren emaitzak. Oinarrian dagoen ideia azaltzen du, kontrolekin osatutako plaken atlas ilustratibo bat aurkezten du, eta testuliburuetako irudiak engainagarriak diren kasuak zehazten ditu.

Plakaren oinarrian dagoen ideia

EMB agarra selektiboa eta diferentziala da aldi berean. Eosina Y eta metileno-urdina koloratzaileek organismo Gram-positibo askoren hazkuntza inhibitzen dute; beraz, inguruneak Gram-negatiboen hazkuntza bultzatzen du. Koloratzaile horiek adierazle gisa ere jarduten dute: organismo batek eskuragarri dagoen azukrea hartzitzen duenean eta tokian bertan nahikoa azido sortzen duenean, koloniak koloratzaile ugari hartzen du eta purpura ilunetik urdin-beltzera bitarteko kolorea hartzen du. Azido-ekoizpena bizia denean, koloniaren gainazalak irideszentzia berde metalikoa izan dezake. Eosina eta metileno-urdina dituzten agar-plaketarako ASM protokoloak hautaketaren eta bereizketaren konbinazio hori deskribatzen du, eta irakaskuntzarako erreferentziazko argazkiak eskaintzen ditu.

Edozein emaitza irakurri aurretik, xehetasun bat garrantzitsua da: egiaztatu zer formulazio erabiltzen den. Holt Harris Teague formulazio zaharragoak laktosa eta sakarosa ditu; Levine EMB formulazioak, berriz, laktosa baino ez du. Sakarosa baina ez laktosa hartzitzen duen organismo batek, Serratia marcescens-en isolatu askok esaterako, itxura desberdina izan dezake bi bertsioetan. EMB inguruneei buruzko fabrikatzailearen dokumentazioak esplizituki adierazten du formulazioen arteko alde hori. Idatzi fabrikatzailea eta formulazioa koadernoan, emaitzarekin batera.

Prestatutako eta inokulatu gabeko EMB agarra gorri-marroixkatik purpura gorrixkara bitartekoa izan ohi da, batzuetan tonu berdexka edo prezipitatu fina duela. Hondoko kolore hori ez da hazkuntza. Alderatu irakurketa bakoitza inokulatu gabeko plaka batekin edo dokumentatutako oinarrizko itxurarekin, eta irakurri lehen plaka 35 eta 37 C bitartean 18 eta 24 ordu inguruko inkubazio aerobikoa egin ondoren, irakaskuntza-protokoloak besterik zehazten ez badu. Inkubazioa luzatzeak hartziduraren itxura alda dezake.

Nola behatu plaka

Erabili bi argiztapen mota. Lehenik, aztertu plaka argi islatuarekin edo zeiharrarekin eta okertu: distira metalikoa irideszentea da, eta behaketa-angeluaren arabera agertu edo desagertu daiteke. Ondoren, aztertu argi transmitituarekin, kolonien kolorea eta erdigune ilunak ebaluatzeko. Erabili ondo isolatutako koloniak; izan ere, pilaketak eta alboko koloniek tokiko azido-metaketa aldatzen dute, eta kolorea moteldu edo areagotu dezakete. ASMren irudi-bildumak zuzenean erakusten du hori: kultibo mistoan, E. coli-k espero den distira gal dezake, inguruko organismoek ingurune azidoa aldatzen dutelako.

Sartu kontrolak ariketak ahalbidetzen duen guztietan. Irakaskuntzan ohikoa den kontrol-multzo batek E. coli ATCC 25922 erabiltzen du kolore urdin-beltzaren eta distira metalikoaren fenotiporako; hartzitzen ez duen organismo bat, hala nola Salmonella Typhimurium ATCC 14028 edo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, fenotipo koloregabe baterako; eta Gram-positibo bat, hala nola Enterococcus faecalis edo Staphylococcus aureus, inhibizio-kontrol gisa, EMB inguruneen kalitate-kontrolerako taula estandarretan zerrendatzen den moduan. Kontrol positiboak distirarik ez badu, aztertu lehenik inkubazioa, pilaketa edo formulazioa, lagin ezezagunaz susmatu aurretik.

Plaken atlas ilustratiboa

Beheko plakak sortutako ilustrazioak dira, ez benetako kultiboen argazkiak. Bilatu beharreko eredua erakusten dute, ez andui jakin baten tonu zehatza. Alderatu ASMren erreferentziazko argazkiekin eta irakaskuntza-laborategiko benetako plakekin.

1. plaka: Escherichia coli EMB agarrean, laktosa indarrez hartzitzen duen organismoa

EMB agarrean, E. coli purpura ilunetik urdin-beltzera bitartekoa izan ohi da, sarritan erdigune ilunarekin eta azido-ekoizpen biziak eragindako distira berde metalikoarekin. Distira da ikasleek bilatzen duten ezaugarri ospetsua, baina hartu froga osagarri gisa, ez definizio gisa. Distiraren intentsitatea anduiaren, inkubazio-denboraren, kolonien dentsitatearen eta behaketa-angeluaren arabera aldatzen da. Distirarik ez izateak ez du E. coli baztertzen, eta distirarik gabeko kolonia ilun batek beste hainbat hartzitzaileren presentzia iradokitzen du. Aukeratu ondo isolatutako kolonia bat ondorengo edozein lanetarako, pilatutako sektore batetik irakurri beharrean.

2. plaka: Klebsiella pneumoniae EMB agarrean, hartzitzaile mukoidea

EMB agarrean, Klebsiella pneumoniae-k kolonia handi, distiratsu eta mukoideak sortu ohi ditu, arrosa-purpuratik marroi-purpurara bitarteko tonuekin; sarritan erdigune ilunak dituzte, baina normalean ez dute distira metaliko nabarmenik. Antzeko morfologia agertzen da ahaide diren hartzitzaileetan, hala nola Enterobacter-en. Testura mukoidea eta koloniaren tamaina irakurketaren parte dira: kolonia arrosa txiki eta lau batek ez du kupula-itxurako kolonia mukoide handi baten interpretazio-pisu bera. E. coli-rekin bezala, plakak hartzidura-fenotipo bat iradokitzen du, eta espezie-mailako izendapenak behean deskribatutako berrespen biokimikoa behar du.

3. plaka: Salmonella EMB agarrean eta beste ez-hartzitzaile batzuk, kolonia koloregabeak

EMB agarrean, Salmonella eta laktosa hartzitzen ez duten antzeko organismoak, Shigella eta Pseudomonas-en isolatu asko barne, kolonia koloregabe, zeharrargi edo anbar zurbil gisa hazten dira normalean. Formulazio eta baldintza batzuek tonu arrosaxka ahula ematen dute; beraz, kolonia arrosa zurbil bat ez da automatikoki hartzitzailea. EMB agarrek ez du Salmonella bereizten Shigella-tik edo beste ez-hartzitzaile batzuetatik; bereizketa hori ondorengo probei dagokie. Kontuan hartu, halaber, dokumentatu direla laktosarekiko positiboak diren Salmonella anduiak, E. coli-ren antzeko kolonia metalikoak dituztenak; hori beste arrazoi bat da plaka bakar batek auzia ezin duela itxi esateko.

4. plaka: Serratia marcescens eta formulazioaren tranpa

Serratia marcescens-ek bere atala merezi du, ikasleek sarritan kolonia gorriak espero dituztelako eta, ondorioz, plaka gaizki irakurtzen dutelako. Isolatu kliniko gehienek ez dute laktosa hartzitzen; beraz, Levine EMB agarrean itxura zurbila edo kolore ahulekoa izan ohi dute. Isolatu askok sakarosa hartzitzen dutenez, sakarosa duen formulazio batek erreakzio ilunagoa edo azidoarekin lotuagoa eman dezake. Ez espero prodigiosina pigmentu gorri klasikoa 35 eta 37 C bitartean ere; pigmentu-ekoizpena ez da fidagarria inkubagailuaren tenperaturan. Protokoloak Serratia marcescens EMB agarrean aipatzen duenean, egiaztatu baieztapenak zer formulazio hartzen duen oinarritzat. Serratia-ren metabolismoari buruzko berrikuspen batek tranpa horren atzean dagoen eredua laburbiltzen du: laktosarekiko negatiboa eta sakarosarekiko aldakorra.

5. plaka: kontrolak eta inhibitutako organismoak

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus eta Bacillus bezalako organismo Gram-positiboen hazkuntza oro har inhibitu edo nabarmen mugatzen da EMB agarrean, nahiz eta inhibizioa ez den erabatekoa andui guztientzat. Kontrol-panel batek irakurketa zintzoa egiten laguntzen du: E. coli kontrolak hazkuntza ona erakutsi behar du, kolore urdin-beltzarekin eta distirarekin; ez-hartzitzailearen kontrolak hazkuntza koloregabea erakutsi behar du; eta inhibizio-kontrolak hazkuntza urria edo batere hazkuntzarik ez. Inhibizio-kontrola ondo hazten bada, hautaketa-urratsak huts egin du, eta sorta horretako gainerako irakurketa guztiak zalantzazkoak dira. Tindaketa-metodoek kultibo-inguruneek ez bezalako galdera bati erantzuten diote; laborategiko portaobjektuen tindaketari dagokionez, ikusi metileno-urdinarekin tindatzeko atlasa.

Konparazio mugatua

Hiru esaldik laburbiltzen dituzte itxura engainagarriak. Iluna izateak ez du esan nahi E. coli denik, Klebsiella-k, Enterobacter-ek eta beste hartzitzaile batzuek distirarik gabeko erdigune ilunak garatzen baitituzte. Arrosa izateak ez du esan nahi Klebsiella denik, neurriz edo poliki hartzitzen duten organismoak eta ez-hartzitzailetzat jotzen diren batzuk arrosa edo izpiliku-kolorekoak agertzen baitira. Distira izateak ez du E. coli behin betiko identifikatzen, indarrez hartzitzen duten beste organismo batzuek ere sor baitezakete. Irakaskuntza-protokoloak eta haren kultibo mistoen irudiek akats horietako bakoitza erakusten dute.

Berrespenaren mugak

EMB agarrek fenotipo baten berri ematen du, ez espezie baten berri. Organismo desberdinek kolonia-itxura bera izan dezakete, eta organismo bera testuliburuetako iruditik aldendu daiteke anduiaren, adinaren, pilaketaren, formulazioaren eta inkubazioaren arabera. Horregatik, irakaskuntzako eta klinikako lan-fluxuek ustezko identifikaziorako ezaugarritzat hartzen dute EMBko morfologia.

Ikasleentzako lan-fluxu defendagarri bat hau da: deskribatu kolonia isolatua —tamaina, kolorea, erdigunea, argi zeiharreko distira eta izaera mukoidea—, eta erregistratu formulazioa, inkubazio-denbora eta -tenperatura eta kontrolak; ondoren, egin ondo isolatutako kolonia baten azpikultura kultibo purua lortzeko, edozein berrespen-proba egin aurretik. Ohiko jarraipen-proben artean daude Gram tindaketa eta IMViC erreakzioak, E. coli eta koliformeen ustezko identifikaziorako; TSI edo KIA eta organismo bakoitzerako berariazko panel biokimikoak, organismo enterikoetarako; eta identifikazio serologikoa, MALDI TOF bidezkoa edo baliozkotutako beste metodo bat, zereginak hala eskatzen duenean. EMB agarra ingurune enteriko selektibo eta diferentzialen artean nola kokatzen den jakiteko, ikusi kultibo-ingurune enterikoei buruzko sarrerak eta Gram tindaketaren ondorengo probak. Portaobjektu bateko tindaketa urdin batek zer froga dezakeen eta zer ez aztertzeko, metileno-urdinarekin tindatzeko atlasak behaketa eta ondorioa bereizten ditu, ikuspegi berari jarraituz.

Idatzi behaketa ondorioa baino lehen. "Levine EMB agarrean 24 ordura, angeluaren araberako distira berdea duten kolonia urdin-beltz ilunak, laktosaren hartzidura biziarekin bateragarriak" defendagarria da. "E. coli, berretsita" idazteko, plakak bere kabuz eman ezin duen berrespen-urratsa behar da.