Metüleensinise identifitseerimine laboris: infrapunaspektrid ja täiendavad meetodid

Kujutle, et kolm laborit saavad sama sinise pulbri. Esimene registreerib infrapunaspektri ja tunnistab aine metüleensiniseks. Teine teeb kromatograafilise analüüsi ja teatab, et proov sisaldab 0.4% Azure B-d. Kolmas uurib kristalle röntgendifraktsiooniga ja määrab hüdraadivormi. Kõigil kolmel on õigus, kuid ükski neist pole vastanud ülejäänud kahele küsimusele. Segadus tekib siis, kui ühte tulemust tõlgendatakse vastusena kõigile kolmele.

See artikkel käsitleb neid küsimusi eraldi. Infrapunaspektroskoopiline identifitseerimine kinnitab molekulaarse identiteedi võrdlusstandardi alusel. Kromatograafia määrab koostise. Difraktsioon määrab tahke faasi vormi. Nõuetele vastav identifitseerimistulemus ei ole puhtussertifikaat.

Infrapunaspektroskoopiline identifitseerimine vastab hästi ühele küsimusele

Metüleensinise farmakopöakohane identifitseerimiskatse põhineb spektri võrdlemisel standardiga, mitte piikide kontrollnimekirjal. USP metüleensinise monograafia eelvaates viitab identifitseerimiskatse A infrapunaspektroskoopiale, milles kasutatakse kas ATR-optikat või kaaliumbromiiditabletti. Proovi spekter peab vastama USP võrdlusstandardi spektrile ning proov ja standard peavad olema ette valmistatud ja nende spektrid registreeritud samaväärsetes tingimustes. Tulemust ei määra ükski kindel diagnostiliste lainearvude loend. Selle määrab spektrite kattuvus.

Selline lähenemine peegeldab metüleensinise FTIR-spektrite omadusi. Tugevaimad tunnused paiknevad sõrmejäljepiirkonnas. Kirjanduses esitatud omistused paigutavad peamise konjugeeritud tsüklite riba järjepidevalt vahemikku 1590 kuni 1600 cm-1, kus aromaatsete süsiniku-süsiniku ja süsiniku-lämmastiku sidemete venitusvõnkumised on omavahel seotud. Täiendavad ribad ligikaudu 1490 ja 1390 cm-1 juures on seotud tsüklite, süsiniku-lämmastiku ja süsiniku-vesiniku deformatsioonvõnkumistega. Ribad ligikaudu 1355 ja 1330 cm-1 juures hõlmavad dimetüülaminorühmade süsiniku-lämmastiku sidemeid ja metüülrühmade deformatsioonvõnkumisi. Tunnused vahemikus ligikaudu 1225 kuni 1250 cm-1 kuuluvad heterotsüklilisele karkassile, ribad vahemikus ligikaudu 1170 kuni 1130 ja 1066 cm-1 juures on seotud süsiniku-väävli võnkumistega ning aromaatsed C-H paindevõnkumised paiknevad ligikaudu 880 cm-1 juures. Venitusvõnkumised ilmnevad suuremate lainearvude juures: aromaatne C-H ligikaudu 3040 cm-1 ning N-metüülrühmade C-H ligikaudu 2900 kuni 3000 cm-1. Avaldatud omistused erinevad üksikasjades, sest fenotiasiiniumi karkass võngub seotud süsteemina, seega tuleks iga üksikut omistustabelit käsitleda avaldatud tõlgendusena, mitte ainsa võimaliku tõlgendusena.

Tähelepanu väärivad kaks proovi ettevalmistamise mõju, sest need muudavad metüleensinise IR-spektreid ilma värvainet muutmata. Esiteks näitab hüdraatunud materjal laia O-H riba piirkonnas 3300 kuni 3500 cm-1 ning vee paindevõnkumist ligikaudu 1630 kuni 1640 cm-1 juures; erinevad hüdraadivormid nihutavad sõrmejäljepiirkonna ribasid mõõdetavalt. Teiseks on KBr-tableti maatriks hügroskoopne: neeldunud niiskus tekitab ribasid täpselt neis vee piirkondades ja seda võib ekslikult pidada proovi hüdraatveeks. ATR-mõõtmine väldib KBr-maatriksit, kuid ATR-spektri intensiivsused sõltuvad lainearvust sõltuvast penetratsioonisügavusest, mistõttu sama pulbri ATR-spekter ja läbilaskvusspekter ei ole otse ülekantavad. Praktiline reegel tuleneb farmakopöa nõudest: võrdle sama tehnikaga registreeritud proovi ja võrdlusstandardi spektreid ning dokumenteeri kasutatud tehnika. Nende spektrite aluseks oleva katiooni, soola ja hüdraatide keemia kohta loe metüleensinise struktuuri ja omaduste ülevaadet.

Analüüsimeetodi valimise tabel

See tabel aitab meetodit valida. Loe rida vasakult paremale, et näha, millisele küsimusele meetod vastab, mida nõuetele vastav tulemus kinnitab ja mis jääb tõendamata.

Miks infrapunaspektrite vastavus ei ole puhtussertifikaat

Identifitseerimisel tuvastatud vastavus välistab vale värvaine. See ei anna proovi täielikku koostist. Kõige olulisemad on kolm piirangut.

Esiteks näevad lähedased ühendid infrapunapiirkonnas sarnased välja. Azure B erineb metüleensinisest ühe metüülrühma võrra, seega sarnaneb selle spekter väga metüleensinise spektriga. Mõne protsendi Azure B-d sisaldava segu spekter kattub endiselt hästi metüleensinise võrdlusspektriga. Selle lisandi tuvastamine on kromatograafia ülesanne, mida käsitleb metüleensinise lisandite ja katsemeetodite juhend.

Teiseks on infrapunaspektroskoopia kogu proovi iseloomustav meetod, mille tundlikkus väikese sisaldusega komponentide suhtes on piiratud. Väikesed kogused sarnaseid värvaineid, lahustijääke või anorgaanilisi jääke peituvad peamiste ribade alla. Täiendavate piikide puudumine on nõrk tõend lisandite puudumise kohta.

Kolmandaks määrab võrdlusstandard kogu võrdluse aluse. Lagunenud, hüdratatsiooni tõttu nihkunud spektriga või valesti käsitsetud standard muudab hindamise lähtepunkti. Sama teeb sobimatute tehnikate paaritamine, näiteks ATR-proovispektri hindamine KBr-võrdlusspektri alusel. Dokumenteeri iga otsuse juures standardi partii, tehnika ja ettevalmistus.

Segude puhul lisandub veel üks hoiatus. Spekter, mis valdavalt vastab võrdlusspektrile, kuid millel on õlad või ebatavalised intensiivsused, ei tähenda märkustega heakskiitu. See annab märku vajadusest proovi komponendid enne identifitseerimist eraldada.

Täiendavad meetodid praktikas

Metüleensinise HPLC annab vastuse koostise kohta, mida infrapunaspektroskoopia anda ei saa. Praegune farmakopöameetod kasutab fenüültüüpi kolonni ja trifluoroäädikhapet sisaldavat vee-atsetonitriili gradienti ning detekteerib lainepikkusel 246 nm, mitte nähtava valguse piirkonnas. Identiteet määratakse retentsiooniaja vastavuse alusel võrdlusstandardile; sama võrdlus võimaldab määrata ka sisaldust. Orgaaniliste lisandite katses määratakse Azure B selle enda võrdlusaine abil suhtelise retentsiooniaja juures ligikaudu 0.8, võrreldes metüleensinise väärtusega 1.0, ning nõutakse nende kahe piigi head lahutust. Pane tähele lainepikkuse valikut: demetüleerumisrea neeldumine nihkub järjest punase piirkonna poole, alates tioniinist ligikaudu 600 nm juures ning liikudes läbi Azure C, Azure A ja Azure B kuni metüleensiniseni ligikaudu 670 nm juures. Ligikaudu 660 nm juures fikseeritud detektor reageerib seetõttu rea ühenditele erinevalt ja alahindab mõningaid homolooge. Vajaduse korral tuleb kogu rea täielik profiil määrata C18 LC-MS/MS-meetodiga, kasutades iga analüüdi jaoks kvalifitseeritud standardeid.

Pulberdifraktsioon vastab tahke faasi küsimusele, mille teabe mõlemad eespool kirjeldatud meetodid kas hävitavad või tähelepanuta jätavad: pulbri lahustamine kromatograafia jaoks kustutab kristalliteabe ning molekulaarsed võnkumised annavad teavet sidemete, mitte pikamaa korrastatuse kohta. Difraktsioonimustrid eristavad hüdraatfaase ja kristallilisust ning metüleensinine vajab sellist uurimist rohkem kui enamik materjale. Rageri ja tema kolleegide tahke faasi uuringud tuvastasid viis erinevat hüdraadistruktuuri, sealhulgas pentahüdraadi, kaks dihüdraati, monohüdraadi ja vahepealse hüdraadi, ning ei leidnud iseloomustatud vormide seast ühtegi tõelist trihüdraati. Siin on oluline laboris käsitsemine: niiskus ja temperatuur muudavad hüdraatide stabiilsust ning intensiivne jahvatamine võib muuta faasi või vähendada kristallilisust, seega kontrolli ja dokumenteeri suhtelist õhuniiskust ja temperatuuri ning jahvata võimalikult vähe. Hüdraatide märgistust ja selle mõju kaalutud massile käsitletakse põhjalikumalt artiklis metüleensinise hüdraadivormid ja märgistus.

UV-Vis-neeldumisel on toetav roll. Tuttavad maksimumid kinnitavad lahuse ootuspärast käitumist ja võimaldavad määrata kontsentratsiooni, kuid eeldatud lainepikkusel neelav sinine lahus on metüleensinisega kooskõlas ilma selle identiteeti tõestamata, sest sarnased värvained neelavad lähedastel lainepikkustel.

Mida enne ostmist küsida

Muuda need eristused ostuküsimusteks. Küsi, millist partiid analüüsiti, milline tehnika kinnitas identiteedi, kas HPLC lisandikatses kasutati Azure B võrdlusainet ning kas hüdraadivorm määrati või eeldati. Eelkõige küsi, kas sertifikaat hõlmab kogu spetsifikatsiooni või ainult valitud katseid. Paljud müüjad, kes väidavad farmakopöanõuetele vastavust, kontrollivad ainult raskmetalle, jättes identiteedi, sisalduse, orgaaniliste lisandite, lahustite ja mikrobioloogilised küsimused vastuseta.

Blupreme kontrollib koostöös metüleensinise ravimitootjaga kogu USP spetsifikatsiooni, mis hõlmab identiteeti, puhtust, orgaanilisi lisandeid, lahustijääke, elementlisandeid, kuumutusjääki, mikrobioloogilisi piirmäärasid ja bakteriaalseid endotoksiine. Iga partii avalik analüüsisertifikaat avaldatakse lehel Blupreme kvaliteedikontroll, et sisaldusmääramise alust ja lisandite tulemusi saaks otse lugeda, mitte kaudselt järeldada. Ka 100% lähedaste tulemuste puhul tuleb märkida arvutusalus, nagu selgitab üle 100 protsendi ulatuva sisaldusmääramise juhend. Identiteedi vastavus avab uurimise. Täielik dokumentatsioon viib selle lõpule.