Medición de especies reactivas de oxígeno en experimentos con azul de metileno

Dos laboratorios realizan lo que ambos llaman un experimento antioxidante con azul de metileno. Uno informa que el colorante suprime las especies reactivas de oxígeno. El otro informa que las genera. Ambos muestran curvas dosis-respuesta limpias. Ambos son sinceros. La diferencia no es fraude ni incompetencia. Es que los dos grupos midieron cosas diferentes bajo luces diferentes, con sondas que responden preguntas diferentes, y después describieron ambas respuestas con la misma palabra: ROS.

El azul de metileno es una molécula difícil de medir con precisión porque participa en la química que se supone que debe observar. En la oscuridad intercambia electrones entre donantes y aceptores y vuelve a su forma inicial, lista para repetir el ciclo. Bajo luz se convierte en un fotosensibilizador, alcanzando un estado triplete excitado desde el cual puede transferir energía al oxígeno para producir oxígeno singlete o transferir electrones para generar radicales y peróxido de hidrógeno. Cualquier sonda colocada en ese sistema puede oxidarse, reducirse, blanquearse u ocultarse ópticamente por el propio colorante. Por eso la primera pregunta de cualquier lectura de ROS nunca es cuál es el número. Es qué detecta realmente el ensayo y qué efecto tiene el colorante sobre el ensayo.

Amplex Red: un ensayo calibrado de peróxido de hidrógeno

La combinación azul de metileno Amplex Red es la asociación más defendible en esta literatura cuando se configura correctamente. La química es específica: la peroxidasa de rábano picante utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar el sustrato Amplex hasta un producto fluorescente, resorufina, en una estequiometría aproximadamente uno a uno. El peróxido de la muestra se convierte en fluorescencia en el detector. Nada más de la familia ROS clásica impulsa directamente esa reacción.

La ventaja decisiva es la calibración. Un operador cuidadoso ejecuta estándares conocidos de peróxido en el mismo tampón, con las mismas concentraciones de peroxidasa y sustrato, el mismo tiempo de incubación y los mismos ajustes ópticos, y después compara las muestras con esa curva. En el estudio de mitocondrias cerebrales aisladas que fundamenta este método, los autores hicieron exactamente eso, añadiendo cantidades conocidas de peróxido al final de cada ejecución, y los valores se expresan como tasas en picomoles por minuto por miligramo de proteína en lugar de unidades arbitrarias de fluorescencia. Eso es lo que convierte un brillo en una medición.

Tres detalles de ese estudio merecen ser imitados. Primero, los autores verificaron la señal con catalasa, que destruye el peróxido. El aumento de fluorescencia inducido por azul de metileno se detuvo cuando se añadió catalasa, confirmando que la señal era peróxido y no un artefacto óptico. Segundo, probaron directamente la iluminación cerrando el haz de excitación para que las muestras recibieran un octavo de la dosis normal de luz, y la señal disminuyó solo un nueve por ciento. Más del noventa por ciento del peróxido informado era independiente de la luz de medición. Tercero, midieron por separado la eliminación de peróxido con un electrodo y encontraron que el colorante aumentaba tanto la producción como la ralentización de la eliminación. Una sonda que solo informa fluorescencia neta habría confundido esos dos efectos.

El ensayo todavía tiene modos de fallo, y el azul de metileno presenta varios. El colorante absorbe ampliamente en la misma región roja donde emite la resorufina, por lo que a concentraciones altas puede ocultar su propia señal mediante efectos de filtro interno. Por ello, los estándares deben contener la misma concentración de colorante que las muestras. Amplex Red también puede fotooxidarse por sí solo, y su producto resorufina puede entrar en ciclos fotoredox que generan superóxido y peróxido, algo muy relevante cuando el experimento también ilumina un fotosensibilizador. La solución práctica es irradiar primero las muestras con azul de metileno y analizar alícuotas con reactivos Amplex en oscuridad, en lugar de iluminar simultáneamente colorante y sonda. Finalmente, la superóxido dismutasa no simplemente reduce una señal Amplex: convertir superóxido en peróxido puede aumentarla. Un control con SOD que incrementa la fluorescencia no ha fallado. Ha identificado al superóxido como especie previa.

DCFDA: un indicador inespecífico de oxidación

La combinación azul de metileno DCFDA es la fuente de gran parte de la confusión. DCFH-DA es un precursor para cargar células. Las esterasas dentro de la célula eliminan sus grupos acetato dejando DCFH no fluorescente, y la oxidación de DCFH produce DCF fluorescente. Lo oxida una lista amplia: radicales hidroxilo, peroxidasa e intermediarios de hemo, dióxido de nitrógeno, ácido hipocloroso y radicales derivados de peroxinitrito. El peróxido de hidrógeno por sí solo no lo oxida directamente a una velocidad útil; la fluorescencia dependiente de peróxido generalmente requiere hierro, proteínas hemo o química de peroxidasa en el circuito.

La crítica que debería citarse en toda sección de métodos proviene del análisis de DCFH como sonda realizado por Kalyanaraman y colaboradores, resumido en el estudio de mitocondrias cerebrales que rechazó DCFDA por esta razón, donde mostraron que el colorante reacciona lentamente, con estequiometría no caracterizada, sin calibración válida y con compuestos no ROS. La sonda también amplifica lo que mide: la oxidación de un electrón de DCFH produce un radical DCF que reacciona con oxígeno para formar superóxido, que se dismuta a más peróxido. La lectura genera parcialmente la química que informa.

Nada de esto hace inútil a DCFDA. Lo convierte en una prueba de detección, no de identificación. Un aumento de fluorescencia DCF significa que aumentó la oxidación dependiente de oxidantes de la sonda. No significa que aumentó el peróxido, y ciertamente no significa que aumentaron las ROS totales, una cantidad que ninguna sonda individual mide. Trabajos anteriores con azul de metileno que dependían de la oxidación de DCF por encima de un micromolar informaron efectos prooxidantes, mientras que otros sistemas de la misma época informaron protección contra muerte celular inducida por peróxido. Ambas observaciones pueden ser ciertas para el mismo colorante en contextos redox diferentes, y el resultado DCF por sí solo no puede indicar qué oxidante produjo la señal. La importancia del trabajo anterior en mitocondrias cerebrales es que reemplazó esta prueba con una medición calibrada de peróxido y encontró la carga directamente: incluso cien nanomolares de colorante aumentaron varias veces la liberación de peróxido en todos los sustratos y estados respiratorios probados.

DCFDA tiene otra trampa específica del azul de metileno. El colorante tiene un color intenso y es redox activo, por lo que puede blanquear fluorescencia, apagar emisiones u oxidar la química de la sonda independientemente de las ROS celulares. Un control sin células con colorante más sonda no es un adorno opcional. Es el experimento que indica si el colorante interactúa con la sonda.

Atrapamiento de espín y consumo de oxígeno: identidad y flujo

Mientras las sondas fluorescentes informan que apareció algo oxidable, la resonancia de espín electrónico con trampas de espín informa algo más cercano a qué era. El estudio clásico de fotoquímica del azul de metileno utilizó ESR para detectar el radical ascorbato procedente de colorante, ascorbato y luz, después mostró formación de peróxido en experimentos de consumo de oxígeno y formación de radical hidroxilo catalizada por hierro en ensayos de atrapamiento de espín. Cada técnica respondió a la pregunta que las otras no podían: ESR dio identidad del radical, el consumo de oxígeno dio flujo de reacción independiente de cualquier artefacto fluorescente y la combinación mostró que vías de oxígeno singlete y radicales funcionaban en el mismo sistema iluminado.

Ese resultado de 1984 todavía funciona como advertencia. Con iluminación y un agente reductor presente, el colorante generó peróxido, y con hierro presente el sistema produjo radical hidroxilo, la especie más reactiva del conjunto. Los autores relacionaron esto con ascorbato en el ojo y cuestionaron el uso oftálmico casual. Los lectores modernos deben observar las condiciones: luz más reductor más hierro. Eliminar cualquiera de ellos debilita o elimina la vía.

Los electrodos de oxígeno tienen su utilidad de otra forma. Un electrodo tipo Clark mide consumo neto de oxígeno, lo que establece que la química redox impulsada por el colorante consume oxígeno molecular y proporciona cinéticas que ningún artefacto fluorescente puede falsificar. No identifica el producto. Peróxido, superóxido, agua y descomposición de oxígeno singlete consumen oxígeno. El flujo sin identidad es tan incompleto como la identidad sin flujo, por lo que los estudios sólidos combinan el electrodo con un ensayo calibrado de peróxido o una trampa.

Por qué los resultados antioxidantes entran en conflicto

Si se colocan las tres lecturas juntas, las aparentes contradicciones en la literatura del azul de metileno se resuelven como diferencias de método más tres hechos biológicos.

Primero, el colorante es tanto un transportador de electrones como una fuente de peróxido. Al desviar electrones de sitios respiratorios donde el oxígeno se convertiría en superóxido, puede reducir una ROS mientras su forma reducida reduce directamente oxígeno a peróxido, aumentando otra. Un laboratorio que estudie química redox mitocondrial y su función de bypass debe esperar respuestas dependientes de la sonda: una lectura sensible a superóxido disminuye mientras una lectura de peróxido aumenta en la misma cubeta.

Segundo, el peróxido en dosis bajas es una señal, no solo daño. El estudio de mitocondrias cerebrales de ratón que siguió al trabajo anterior encontró generación de peróxido con tan solo cincuenta nanomolares de colorante sin lesiones de ADN mitocondrial a niveles terapéuticos, con protección frente a lesiones inducidas por rotenona después del pretratamiento. Solo a cien micromolares, muy por encima del rango terapéutico, el colorante dañó fragmentos de ADN seleccionados, y la luz roja más veinte micromolares de colorante produjo oxígeno singlete que dañó todos los fragmentos probados. El mecanismo propuesto es hormético: una producción leve de peróxido activa defensas antioxidantes relacionadas con Nrf2 y biogénesis mitocondrial, por lo que una lectura prooxidante a corto plazo precede a un resultado antioxidante a largo plazo. Un ensayo leído a una hora y otro leído a un día pueden discrepar porque la biología cambió entre ambos.

Tercero, la luz decide qué molécula está realmente presente. La iluminación desmetila el colorante hacia Azure B y productos relacionados, y la lámpara del microscopio sobre una placa es suficiente para fotosensibilizarlo. Los experimentos en oscuridad e iluminados son experimentos diferentes, y la sección de controles de iluminación y manejo del colorante de cualquier protocolo debe tratarlos así.

Conjunto mínimo de controles y cómo interpretar cualquier afirmación

La comparación siguiente es el recurso de referencia original de este artículo. Antes de aceptar cualquier resultado de ROS con azul de metileno, compruebe qué fila completaron los autores y cuál omitieron.

Una regla práctica de interpretación sigue de esto. Amplex con peroxidasa, calibrado y con comprobación de catalasa, aporta evidencia sobre peróxido. DCFDA aporta evidencia sobre oxidación inespecífica de la sonda y nada más. El atrapamiento de espín con controles de eliminadores aporta evidencia sobre identidad de radicales. El consumo de oxígeno aporta evidencia sobre flujo. Una frase que afirma más de lo que su ensayo puede demostrar, por muy segura que parezca, es una frase sobre la sonda, no sobre el colorante. Las discusiones relacionadas sobre dependencia de dosis y rango hormético, flujo electrónico mitocondrial, interferencia de ensayos en muestras teñidas, y artefactos de iluminación en microscopía amplían estos puntos, y cada uno sigue siendo válido una vez que su referencia de marcador se sustituya.