Paul Ehrlich και κυανό του μεθυλενίου: πώς μια χρωστική συνέβαλε στην ανακάλυψη φαρμάκων

Η συμβολή του Paul Ehrlich στην ιατρική δεν ήταν ένα φάρμακο. Ήταν ένα σκεπτικό για το πώς να εξετάζουμε ένα φάρμακο.

Το 1878 υπέβαλε μια διδακτορική διατριβή της οποίας η εισαγωγική ενότητα είχε τίτλο «Η χημική θεώρηση της χρώσης». Υποστήριζε ότι η χρώση μιας τομής ιστού και η βαφή ενός κομματιού υφάσματος ακολουθούν την ίδια λογική. Και στις δύο περιπτώσεις, το χρώμα προσδένεται λόγω χημικής συγγένειας μεταξύ της χρωστικής και του υλικού, όχι επειδή ο ιστός είναι απορροφητικός, λιπαρός ή διαμορφωμένος έτσι ώστε να παγιδεύει μια χρωστική. Ο Ehrlich είχε μεγαλώσει παρακολουθώντας τον ξάδελφό του, τον παθολογοανατόμο Karl Weigert, να παρασκευάζει χρωματισμένες τομές. Αυτό που τραβούσε την προσοχή του δεν ήταν οι εικόνες, αλλά το γεγονός ότι η χρωστική επέλεγε πού θα κατέληγε.

Ο ισχυρισμός ακούγεται μετριοπαθής. Δεν είναι. Αν μια χρωστική προσδένεται σε έναν ιστό για χημικούς λόγους, τότε το πρότυπο χρώσης δίνει πληροφορίες για τη χημεία αυτού του ιστού. Μια χρωματισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα παύει να είναι απλώς μια απεικόνιση και γίνεται μέτρηση.

Αξιοποίησε αμέσως αυτή την ιδέα. Το 1880 συνδύασε το κυανό του μεθυλενίου με όξινη φουξίνη και ονόμασε το μείγμα ουδέτερη χρωστική, ένα neutralen Farbkörper. Το μείγμα διέκρινε τα διαφορετικά είδη λευκών αιμοσφαιρίων εκεί όπου οι μεμονωμένες χρωστικές που χρησιμοποιούνταν τότε δεν μπορούσαν. Δύο χρόνια αργότερα παρουσίασε μια μέθοδο χρώσης των βακίλων της φυματίωσης με ιώδες του μεθυλίου, και ο Koch υιοθέτησε τη διαδικασία στο δικό του έργο.

Η θεωρία που αργότερα έδωσε σε αυτές τις πρακτικές ένα κοινό υπόβαθρο είναι ξεχωριστό ζήτημα, και η χρονολόγησή της συχνά απλουστεύεται. Η θεωρία των πλευρικών αλυσίδων του Ehrlich, η ιδέα ότι μια ουσία δρα σε ένα κύτταρο επειδή τα δύο είναι χημικά συμβατά, ανήκει στη δεκαετία του 1890, όχι στα χρόνια των πειραμάτων με χρωστικές. Το προγενέστερο έργο προσέφερε την αρχική πεποίθηση: η εκλεκτικότητα είναι χημική και, επομένως, μπορεί κανείς να την αναζητήσει αντί να την ανακαλύψει τυχαία.

Το πείραμα που μετέτρεψε τη χρωστική σε χάρτη

Το 1885 ο Ehrlich δημοσίευσε μια μονογραφία για τις ανάγκες του οργανισμού σε οξυγόνο, με υπότιτλο που την περιέγραφε ως μελέτη μέσω ανάλυσης χρώματος. Η μέθοδός του ήταν να χορηγεί με ένεση χρωστικές των οποίων το χρώμα εξαρτάται από την κατάσταση οξείδωσης και κατόπιν να συγκρίνει πώς διαφορετικά όργανα τις ανάγουν ή τις διατηρούν. Η χρωστική χρησιμοποιούνταν ως όργανο μέτρησης, όπως ένα θερμόμετρο: έδινε πληροφορίες για συνθήκες μέσα στον ιστό που δεν μπορούσαν να εξεταστούν άμεσα. Ο ίδιος ο Ehrlich διατύπωσε τον στόχο ως τον προσδιορισμό, με τη βοήθεια συγκεκριμένων χρωστικών, της αναγωγικής ικανότητας των ζωντανών οργάνων.

Το αποτέλεσμα για το κυανό του μεθυλενίου δημοσιεύθηκε το 1886, σε μια εργασία για την αντίδραση της χρωστικής με τη ζωντανή νευρική ουσία, η οποία είχε παρουσιαστεί σε ιατρική εταιρεία τον προηγούμενο Δεκέμβριο. Το κυανό του μεθυλενίου εισαγόταν στην κυκλοφορία ενός ζωντανού ζώου και στη συνέχεια αφαιρούνταν λεπτές τομές ιστού και εκτίθεντο στον αέρα, ώστε η συσσωρευμένη άχρωμη χρωστική να οξειδωθεί ξανά σε κυανή μορφή και να δείξει πού είχε συγκεντρωθεί. Τα νευρικά κύτταρα και οι νευρικές ίνες προσλάμβαναν το χρώμα, και μάλιστα με αρκετή εκλεκτικότητα ώστε η τεχνική να γίνει καθιερωμένη μέθοδος απεικόνισης του νευρικού ιστού. Η ένωση δεν ήταν πλέον μόνο μια χρωστική ουσία που εφαρμοζόταν σε μια νεκρή τομή πάνω στον εργαστηριακό πάγκο. Ήταν ένας δείκτης που κατανεμόταν μέσα σε ένα ζωντανό σώμα, και αυτή η κατανομή μπορούσε να ερμηνευθεί.

Η ιδιότητα στην οποία βασίζονταν και τα δύο πειράματα αξίζει να διατυπωθεί ξεκάθαρα, επειδή από αυτήν εξαρτώνται όλα τα υπόλοιπα σε αυτή την ιστορία. Το κυανό του μεθυλενίου μετατρέπεται αναστρέψιμα. Η ανηγμένη μορφή του, το λευκοκυανό του μεθυλενίου, είναι άχρωμη και, όταν έρχεται σε επαφή με οξυγόνο, επανέρχεται στο κυανό κατιόν. Ένα διάλυμα της χρωστικής με γλυκόζη σε κλειστό βάζο είναι άχρωμο· ανοίξτε το βάζο και γίνεται μπλε. Αναφέρεται ότι ο Ehrlich έδειξε άμεσα αυτό το φαινόμενο, εκθέτοντας χρωματισμένες τομές τόσο σε χλωριούχο σίδηρο όσο και στον αέρα και παρατηρώντας την επανεμφάνιση του χρώματος. Μια χρωστική που αλλάζει χρώμα ανάλογα με την οξειδοαναγωγική κατάσταση του περιβάλλοντός της είναι ένας ανιχνευτής αυτού του περιβάλλοντος.

Έτσι, δύο ιδιότητες συνυπήρχαν. Μια χρωστική μπορούσε να διακρίνει έναν ιστό από έναν άλλο. Και μια χρωστική μπορούσε να γίνεται ορατή ή άχρωμη με μια αλλαγή στην κατάσταση οξείδωσης.

Αν το δούμε αναδρομικά, η δεύτερη ιδιότητα αποτελεί την αφετηρία της χημειοθεραπείας. Αν μια ένωση προσδένεται σε ένα είδος ιστού και όχι σε άλλο, τότε η ίδια ένωση θα μπορούσε να φτάνει σε ένα είδος οργανισμού και όχι σε άλλο. Ο Ehrlich διατύπωσε ευθέως το συμπέρασμα: αν ένα παθογόνο μπορούσε να χρωματιστεί εκλεκτικά, η χρώση θα μπορούσε να υποδηλώνει ειδική βλαπτική επίδραση σε αυτό το παθογόνο. Επομένως, μια χρωστική θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως φάρμακο, στοχεύοντας τον εισβολέα αντί για τον ασθενή.

Η πρώτη δοκιμή σε ασθενή δεν αφορούσε την ελονοσία. Το 1890, μαζί με τον ψυχίατρο Arthur Leppmann, ο Ehrlich ανέφερε ότι το κυανό του μεθυλενίου ανακούφιζε τον πόνο σε νευραλγικές και ρευματικές παθήσεις των μυών, των αρθρώσεων και των τενόντων. Οι δύο άνδρες συζήτησαν αν το φάρμακο θα μπορούσε να δράσει σε ψυχικές παθήσεις και αποφάσισαν να μην το δοκιμάσουν. Ένας Ιταλός γιατρός, ο Pietro Bodoni από τη Γένοβα, προχώρησε παρ’ όλα αυτά. Η εργασία του το 1899 έχει τίτλο που αναφέρεται σε κατασταλτική δράση σε διάφορες μορφές ψύχωσης: περιέγραψε ηρεμία σε δεκατέσσερις ασθενείς με διέγερση και σημείωσε ότι άλλοι γιατροί στη Γένοβα χρησιμοποιούσαν ήδη τη χρωστική για τον ίδιο σκοπό. Η καταστολή δεν είναι επίδραση στην ίδια την πάθηση, και αυτή η διάκριση επανέρχεται διαρκώς σε αυτή την ιστορία.

Η εργασία για την ελονοσία ακολούθησε το 1891, μαζί με τον παθολογοανατόμο Paul Guttmann, στο νοσοκομείο Moabit του Βερολίνου. Το κυανό του μεθυλενίου χορηγήθηκε σε δύο ασθενείς και η αναφορά δημοσιεύθηκε στην Berliner klinische Wochenschrift της 28ης Σεπτεμβρίου 1891. Στην πρώτη περίπτωση, ο ασθενής έλαβε 0.5 g της χρωστικής εφάπαξ το βράδυ της 29ης Ιουνίου· η αναμενόμενη κρίση δεν εκδηλώθηκε πλήρως και το μόνο ενόχλημα που καταγράφηκε στη συνέχεια ήταν ήπια στραγγουρία με μπλε ούρα. Οι εμπύρετες κρίσεις εξαφανίστηκαν τις πρώτες ημέρες και τα παράσιτα είχαν εξαφανιστεί από το αίμα το αργότερο μέχρι την όγδοη ημέρα. Η σύνοψη των ίδιων των συγγραφέων ήταν ότι οι προσδοκίες τους είχαν εκπληρωθεί πλήρως. Δύο περιστατικά χωρίς ομάδα ελέγχου δεν αποτελούν απόδειξη. Η πληρέστερη παρουσίαση για το κυανό του μεθυλενίου και την ελονοσία, συμπεριλαμβανομένων των σύγχρονων δοκιμών, ανήκει σε ξεχωριστή σελίδα. Το ενδιαφέρον ερώτημα εδώ είναι πιο συγκεκριμένο: πόσο από το σκεπτικό του Ehrlich άντεξε όταν δοκιμάστηκε απέναντι στο παράσιτο.

Πού άντεξε το σκεπτικό και πού απέτυχε

Λίγα στοιχεία του μηχανισμού άντεξαν, τουλάχιστον με τη μορφή που πρότεινε ο Ehrlich. Η απλή εκδοχή, στην οποία ένα επίπεδο τρικυκλικό κατιόν παρεμβάλλεται ανάμεσα στα ζεύγη βάσεων του DNA του παρασίτου, δεν ευσταθεί για το Plasmodium. Το κυανό του μεθυλενίου ανάγεται τόσο εύκολα από ένα μολυσμένο ερυθρό αιμοσφαίριο ώστε δεν φτάνει καν στο παράσιτο ως επίπεδο κατιόν, και η εξήγηση της παρεμβολής που ταιριάζει στις χρωστικές ακριδίνης δεν ταιριάζει σε αυτή τη χρωστική.

Αυτό που υποστηρίζουν τα στοιχεία είναι πιο σύνθετο. Το κυανό του μεθυλενίου αναστέλλει την αναγωγάση της γλουταθειόνης του παρασίτου σε συγκεντρώσεις που μπορούν να επιτευχθούν σε έναν ασθενή. Εμποδίζει τη μετατροπή της αίμης σε αιμοζωίνη, την αδρανή χρωστική που σχηματίζει το παράσιτο για να αποφύγει τη δηλητηρίαση από την ίδια του την πέψη της αιμοσφαιρίνης, περίπου εξίσου αποτελεσματικά με τη χλωροκίνη και πολύ αποτελεσματικότερα από την κινίνη. Οι οξειδοαναγωγικοί κύκλοι του παράγουν επίσης δραστικές μορφές οξυγόνου σε ένα κύτταρο που ήδη τις παράγει. Ποιος από αυτούς είναι ο πραγματικός μηχανισμός, ή αν συμβάλλουν όλοι, παραμένει αδιευκρίνιστο.

Υπάρχει μια ακόμη περιπλοκή, η οποία πρέπει να επηρεάζει τον τρόπο με τον οποίο διαβάζεται κάθε ιστορικός ισχυρισμός για αυτή την ένωση. Το εμπορικό κυανό του μεθυλενίου εκείνης της περιόδου δεν ήταν μία μόνο ουσία. Τα δείγματα περιείχαν azure B, το μονοαπομεθυλιωμένο συγγενές παράγωγο, και τα παλαιότερα διαλύματα συσσώρευαν μεγαλύτερες ποσότητές του. Το Azure B είναι μια μεταχρωματική χρωστική με διαφορετικούς στόχους: χρωματίζει το δίκλωνο DNA βαθύ μπλε και το RNA πράσινο. Ένα μείγμα δύο χρωστικών με διαφορετικούς προορισμούς, σε αναλογίες που κανείς δεν κατέγραψε, δεν μπορεί να στηρίξει μια σαφή δήλωση για το τι έκανε το κυανό του μεθυλενίου που περιείχε.

Η ίδια η χρωστική δεν εκτόπισε ποτέ την κινίνη. Η μέθοδος τα πήγε καλύτερα. Ο μαθητής του Ehrlich, Wilhelm Roehl, εργαζόμενος για τον όμιλο χρωστικών και φαρμάκων IG Farben, συνέχισε να προωθεί παράγωγα χρωστικών ως φάρμακα για τροπικές νόσους και παρείχε το εργαλείο που έλειπε: το καναρίνι, μολυσμένο με ελονοσία των πτηνών, ως καθιερωμένο μέσο ελέγχου υποψήφιων ενώσεων. Ο Werner Schulemann τροποποίησε στη συνέχεια την πλευρική αλυσίδα και το άλας φαινοθειαζινίου που προέκυψε θεράπευσε την πειραματική λοίμωξη. Εξακολουθούσε όμως να βάφει τους ασθενείς μπλε.

Το αποτέλεσμα που άντεξε στον χρόνο αποδείχθηκε ότι δεν ήταν ούτε η χρωστική ούτε το σύστημα δακτυλίων, αλλά η πλευρική αλυσίδα. Η προσθήκη μιας διαλκυλαμινοαλκυλαμινομάδας άλλαξε τη συμπεριφορά του μορίου και αυτό το τμήμα διατηρήθηκε σε κάθε μεταγενέστερο επανασχεδιασμό. Αν διατηρηθεί αυτή η ομάδα και αντικατασταθεί ο δακτύλιος φαινοθειαζινίου με έναν δακτύλιο ακριδίνης, το αποτέλεσμα είναι η κινακρίνη. Αν αντικατασταθεί με έναν δακτύλιο κινολίνης, το αποτέλεσμα είναι η χλωροκίνη. Η παμακίνη, η πριμακίνη και η αμοδιακίνη, που παραμένουν όλες στον κατάλογο των ανθελονοσιακών, φέρουν την ίδια ομάδα. Η ένωση που απέτυχε ως θεραπεία παρείχε το τμήμα που πέτυχε.

Η σύνδεση με τα αντιψυχωσικά περνά από τον δακτύλιο και όχι από το φάρμακο. Η διαλεύκανση της δομής του κυανού του μεθυλενίου οδήγησε τον Heinrich August Bernthsen στον μητρικό πυρήνα της φαινοθειαζίνης το 1883. Πάνω σε αυτόν τον σκελετό, με διαφορετικές υποκαταστάσεις, εργάζονταν οι χημικοί της Rhône-Poulenc τη δεκαετία του 1940, αναζητώντας αντιισταμινικά. Μία από αυτές τις ενώσεις συντέθηκε περίπου στα τέλη του 1950 και δοκιμάστηκε από τον χειρουργό Henri Laborit, ο οποίος παρατήρησε ότι άφηνε τους ασθενείς ήρεμους και αδιάφορους. Η πρώτη δημοσιευμένη ψυχιατρική χρήση της, σε έναν ασθενή με μανία, έγινε τον Ιανουάριο του 1952. Το πρώτο αντιψυχωσικό δεν είναι τόσο απόγονος του ανθελονοσιακού του Ehrlich όσο μακρινός συγγενής της χρωστικής από την οποία ξεκίνησε.

Τρεις πρακτικές που αξίζει να κρατήσουμε από αυτό το επεισόδιο

1. Η φράση «πρώτο συνθετικό φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε στην ιατρική» περιγράφει μια κατηγορία, και οι επιφυλάξεις είναι περισσότερες απ’ όσες υποδηλώνει η διατύπωση. Η φράση έχει καθιερωθεί· μια πολυσυζητημένη ανασκόπηση του Schirmer και των συνεργατών του στο Neurobiology of Aging χαρακτηρίζει το κυανό του μεθυλενίου ως το πρώτο πλήρως συνθετικό φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε στην ιατρική. Η ένυδρη χλωράλη εισήχθη ως συνθετικό κατασταλτικό το 1869, περισσότερο από είκοσι χρόνια νωρίτερα. Η ίδια η εργασία του 1891 παρέχει μέρος της απάντησης, επειδή οι συγγραφείς της κατονομάζουν τα συνθετικά αντιπυρετικά που είχαν ήδη αποτύχει κατά της ελονοσίας, μεταξύ αυτών την κινολίνη, την αντιπυρίνη και την αντιφεβρίνη. Το αρσενικούχο φάρμακο του ίδιου του Ehrlich για τη σύφιλη εμφανίστηκε ακόμη αργότερα. Η τεκμηριώσιμη εκδοχή του ισχυρισμού αφορά τη μέθοδο και όχι τη χρονική πρωτιά: το κυανό του μεθυλενίου συγκαταλέγεται στις πρώτες συνθετικές ενώσεις που επιλέχθηκαν για να δράσουν εναντίον ενός συγκεκριμένου οργανισμού βάσει μιας χημικής θεωρίας εκλεκτικότητας.
2. Η εκλεκτική κατανομή δεν συνεπάγεται εκλεκτικό όφελος. Το αποτέλεσμα του Ehrlich το 1886 ήταν ότι η χρωστική κατευθύνεται στον νευρικό ιστό. Το πού πηγαίνει μια ένωση και το τι κάνει όταν φτάσει εκεί είναι δύο διαφορετικές μετρήσεις, και η πρώτη είναι πολύ ευκολότερη. Σε αυτό το κενό εντοπίζονται έκτοτε οι περισσότεροι ισχυρισμοί για το κυανό του μεθυλενίου και τον εγκέφαλο.
3. Η καθαρότητα ανήκει στην τεκμηρίωση, όχι στο μάρκετινγκ. Το ιστορικό αρχείο είναι αμφίσημο ακριβώς γι’ αυτόν τον λόγο. Μικρές δομικές διαφορές αλλάζουν το πού κατευθύνεται αυτή η ένωση, γι’ αυτό ένα πιστοποιητικό ανάλυσης πρέπει να συνδέεται με συγκεκριμένη παρτίδα και όχι να παρουσιάζεται απλώς ως δήλωση ότι ένα προϊόν έχει ελεγχθεί. Ένας πωλητής που ισχυρίζεται συμμόρφωση με τη μονογραφία της φαρμακοποιίας, ενώ ελέγχει μόνο βαρέα μέταλλα, ισχυρίζεται περισσότερα απ’ όσα υποστηρίζει η έκθεση. Η Blupreme προμηθεύεται κυανό του μεθυλενίου από φαρμακευτικό παρασκευαστή και ελέγχει το σύνολο των προδιαγραφών που ορίζει η μονογραφία: ταυτότητα, καθαρότητα, οργανικές προσμείξεις, υπολειμματικούς διαλύτες, στοιχειακές προσμείξεις, υπόλειμμα μετά από πύρωση, μικροβιακά όρια και βακτηριακές ενδοτοξίνες. Η έκθεση δημοσιεύεται μαζί με το προϊόν, και η σελίδα για το κυανό του μεθυλενίου ποιότητας USP εξηγεί αυτά τα όρια και γιατί το αποτέλεσμα για το azure B είναι το πρώτο που πρέπει να αναζητά κανείς.

Μια χρονολογημένη διαδρομή στις πηγές

Η χρονολογική ακολουθία των ορόσημων, συμπεριλαμβανομένης της χημείας των χρωστικών πριν από τον Ehrlich και των βαθμών ποιότητας και προδιαγραφών που ακολούθησαν μετά από αυτόν, παρουσιάζεται ξεχωριστά στην ιστορία του κυανού του μεθυλενίου, ενώ η ταυτότητα της ίδιας της ένωσης καλύπτεται στο άρθρο τι είναι το κυανό του μεθυλενίου.

Τα εικονογραφικά τεκμήρια στα οποία βασίζεται αυτή η αφήγηση, που αναπαράγονται στην ανασκόπηση του 2012 των Krafts, Hempelmann και Skórska-Stania, δεν είναι ισοδύναμα, και ένα παράδειγμα δείχνει γιατί. Η εικόνα του 1891 αποτελεί το πρωτογενές τεκμήριο της δοκιμής· το πορτρέτο του 1910 δίπλα της χρονολογεί μια φήμη και τίποτε άλλο. Σελίδες από το σημειωματάριο του Andersag το 1934 αποτελούν το άμεσο ίχνος της αντικατάστασης με κινολίνη, γραμμένο από το ίδιο το χέρι του χημικού.

Η ειλικρινής σύνοψη των πειραμάτων του Ehrlich με χρωστικές είναι ότι πέτυχε ως προς την εκλεκτικότητα και τον στόχο, αλλά αστόχησε ως προς τον μηχανισμό. Το κυανό του μεθυλενίου πράγματι συγκεντρώνεται στον νευρικό ιστό και πράγματι βλάπτει το παράσιτο της ελονοσίας. Δεν κάνει το δεύτερο εξαιτίας του πρώτου, και η χημική εξήγηση που πρότεινε για τα δύο ήταν λανθασμένη. Αυτό που απέδειξε πέρα από κάθε αμφιβολία ήταν πιο διαχρονικό από έναν σωστό μηχανισμό: μια ένωση μπορεί να επιλεγεί αντί να βρεθεί τυχαία, και να επιλεγεί βάσει στοιχείων που συγκεντρώνονται πριν τη χορηγήσει κανείς σε ασθενή.