Πώς το κυανό του μεθυλενίου εισέρχεται στα κύτταρα: αναγωγή, επανοξείδωση, πρόσληψη

Παρατηρώντας ένα τρυβλίο με ενδοθηλιακά κύτταρα να προσλαμβάνουν κυανό του μεθυλενίου, η προφανής ερμηνεία είναι και η λανθασμένη. Το μέσο χάνει το μπλε χρώμα του, τα κύτταρα αποκτούν μπλε κοκκία, άρα η χρωστική πρέπει να πέρασε τη μεμβράνη ως μπλε μόριο. Τα πειράματα δείχνουν κάτι διαφορετικό. Η μπλε μορφή περνά με μεγάλη δυσκολία. Αυτή που περνά είναι η άχρωμη μορφή, και το μπλε που βλέπετε στο εσωτερικό σχηματίζεται εκεί, μετά την είσοδο.

Αυτή η ανατροπή έχει σημασία, επειδή καθορίζει τι μπορεί και τι δεν μπορεί να σας αποκαλύψει η χρώση. Τα μπλε κοκκία υποδηλώνουν οξειδωμένη χρωστική που επανοξειδώθηκε και παγιδεύτηκε σε οργανίδια. Δεν αποτυπώνουν τη συνολική ποσότητα χρωστικής στο κύτταρο, δεν αποτυπώνουν το ανηγμένο απόθεμα και δεν μετρούν τη βιολογική επίδραση. Για να καταλάβετε γιατί, ακολουθήστε τα τρία βήματα: αναγωγή στην επιφάνεια, διάχυση της ανηγμένης μορφής, επανοξείδωση και παγίδευση στο εσωτερικό.

Οι δύο μορφές συμπεριφέρονται σαν διαφορετικά μόρια

Το οξειδωμένο κυανό του μεθυλενίου είναι ένα επίπεδο, θετικά φορτισμένο σύστημα δακτυλίων. Διαλύεται στο νερό, απορροφά έντονα το φως περίπου στα 600 έως 700 νανόμετρα και φαίνεται μπλε. Το κρίσιμο στοιχείο είναι το φορτίο. Ένα φορτισμένο, υδρόφιλο μόριο δεν περνά εύκολα μέσα από μια λιπιδική μεμβράνη, γι’ αυτό η προσεκτική διατύπωση στη βιβλιογραφία είναι «σχετικά μη διαπερατό από τη μεμβράνη», όχι «μη διαπερατό».

Το ανηγμένο κυανό του μεθυλενίου, που ονομάζεται λευκοκυανό του μεθυλενίου, είναι άχρωμο, χωρίς φορτίο και λιποδιαλυτό. Αν αφαιρεθεί το φορτίο, η μεμβράνη παύει να λειτουργεί σαν τοίχος. Το ανηγμένο μόριο διαχέεται εύκολα διαμέσου της και, μόλις βρεθεί σε ένα περισσότερο οξειδωτικό διαμέρισμα, μπορεί να χάσει ξανά ηλεκτρόνια και να επιστρέψει στην μπλε, φορτισμένη, παγιδευμένη μορφή. Η οξειδοαναγωγική χημεία της χρωστικής είναι επομένως και ο μηχανισμός μεταφοράς της. Αλλάζοντας τον αριθμό των ηλεκτρονίων, αλλάζει και η διαπερατότητα.

Τα ηλεκτρόνια για το πρώτο βήμα προέρχονται από το ίδιο το κύτταρο. Τα κύτταρα των θηλαστικών μεταφέρουν ηλεκτρόνια διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης, μετακινώντας αναγωγικά ισοδύναμα από ενδοκυτταρικούς δότες προς δέκτες στην επιφάνεια. Αυτή η δραστηριότητα διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης είναι μια φυσιολογική κυτταρική λειτουργία, που απαντά στους περισσότερους τύπους κυττάρων. Η αναγωγάση της ενδοθηλιακής επιφάνειας που δρα στις χρωστικές θειαζίνης συμπεριφέρεται όπως άλλες αναγωγάσες σε ένα αποκαλυπτικό σημείο: συνεχίζει να λειτουργεί παρουσία κυανιούχων και αζιδίων, σε δόσεις που αναστέλλουν τα επόμενα βήματα. Αυτός ο διαχωρισμός είναι το κεντρικό σημείο όλης της εξήγησης.

Η κατανομή προηγήθηκε και σχεδόν εξήγησε την πρόσληψη

Το 1929, η Marian Irwin στο Ινστιτούτο Rockefeller έθεσε ένα απλούστερο ερώτημα. Ίσως η είσοδος της χρωστικής να είναι απλώς κατανομή μεταξύ του νερού και των λιπιδικών στιβάδων του κυττάρου, και μια στιβάδα χλωροφορμίου να μπορεί να υποκαταστήσει αυτές τις λιπιδικές στιβάδες στον εργαστηριακό πάγκο. Στις φασματοφωτομετρικές μελέτες διείσδυσής της, ανακινούσε υδατικά διαλύματα χρωστικών με χλωροφόρμιο και συνέκρινε όσα μεταφέρονταν στην οργανική φάση με όσα εισέρχονταν σε ζωντανά κύτταρα φυκών.

Δύο ευρήματα από εκείνη την εργασία εξακολουθούν να αξίζουν προσοχή. Πρώτον, τα εμπορικά διαλύματα κυανού του μεθυλενίου περιείχαν τριμεθυλοθειονίνη, που σήμερα ονομάζεται Azure B, και αυτή η πρόσμειξη διείσδυε ταχύτερα από το ίδιο το κυανό του μεθυλενίου, ιδιαίτερα σε αλκαλικό pH, όπου επικρατεί η λιποδιαλυτή μορφή της ελεύθερης βάσης. Μέρος της φαινομενικής εισόδου κυανού του μεθυλενίου ήταν στην πραγματικότητα επιλεκτική είσοδος Azure B. Δεύτερον, το pH καθόριζε το αποτέλεσμα ρυθμίζοντας την κατάσταση ιονισμού, και τα τραυματισμένα κύτταρα επέτρεπαν την είσοδο πολύ περισσότερης χρωστικής από ό,τι τα άθικτα. Οι συντελεστές κατανομής και η κατάσταση φορτίου καθόριζαν τι απορροφούσαν τόσο το τεχνητό σύστημα όσο και το ζωντανό κύτταρο, ενώ η ομοιότητα μεταξύ τους υποστήριζε την ιδέα ότι στο κυτταρικό όριο υπάρχουν μη υδατικές στιβάδες.

Το μοντέλο ήταν διορατικό ως προς τα λιπίδια και τον ιονισμό, αλλά δεν μπορούσε να διακρίνει μια χρωστική που κατανέμεται διατηρώντας την αρχική μορφή της από μια χρωστική που μετατρέπεται χημικά στην επιφάνεια, περνά με διαφορετική μορφή και μετατρέπεται ξανά στο εσωτερικό. Αυτή η διάκριση απαιτούσε διαφορετικό πείραμα, το οποίο πραγματοποιήθηκε εβδομήντα χρόνια αργότερα στο πνευμονικό ενδοθήλιο.

Αναγωγή έξω, παγίδευση μέσα

Ο Merker και οι συνεργάτες του εργάστηκαν με καλλιεργημένα ενδοθηλιακά κύτταρα πνευμονικών αρτηριών βοοειδών και πρότειναν μια αλληλουχία τριών βημάτων: η οξειδωμένη χρωστική ανάγεται στην κυτταρική επιφάνεια στην άχρωμη, λιπόφιλη μορφή της, η ανηγμένη μορφή διαχέεται προς το εσωτερικό και η ενδοκυτταρική επανοξείδωση αναγεννά την οξειδωμένη μορφή που δεν διαπερνά τη μεμβράνη και συσσωρεύεται. Στη συνέχεια, η μελέτη τους για την πρόσληψη θειαζινών από το ενδοθήλιο έλεγξε αυτή την αλληλουχία επιχειρώντας να τη διακόψει σε συγκεκριμένα σημεία.

Το πρώτο εργαλείο ήταν το σιδηρικυανιούχο, ένας δέκτης ηλεκτρονίων που δεν μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο. Όταν τα επιφανειακά ένζυμα ανάγουν την μπλε χρωστική στην άχρωμη μορφή της έξω από το κύτταρο, το σιδηρικυανιούχο μπορεί να πάρει πίσω αυτά τα ηλεκτρόνια, αναγεννώντας την μπλε χρωστική στο μέσο πριν εκείνη προλάβει να περάσει τη μεμβράνη. Όσο το σιδηρικυανιούχο υπήρχε σε περίσσεια (10 μικρομοριακή χρωστική έναντι 50 έως 500 μικρομοριακού σιδηρικυανιούχου), η πρόσληψη της χρωστικής σχεδόν σταματούσε. Μόνο αφού καταναλωνόταν το σιδηρικυανιούχο συνεχιζόταν η πρόσληψη με τον φυσιολογικό της ρυθμό. Η κινητική έδειχνε το ίδιο με έναν δεύτερο τρόπο. Το σιδηρικυανιούχο εξαφανιζόταν με περίπου σταθερό ρυθμό, συμβατό με μια σταθερή ροή επιφανειακής αναγωγής που τροφοδοτούσε έναν ανακυκλώσιμο μεσολαβητή, ενώ η εξωκυτταρική χρωστική εξαφανιζόταν εκθετικά καθώς εξαντλούνταν το απόθεμά της. Μια σταθερή ροή μαζί με ένα απόθεμα που εξαντλείται σημαίνει ότι το σήμα του σιδηρικυανιούχου αποτυπώνει συνεχή αναγωγή, όχι μόρια χρωστικής που απομακρύνονται από το διάλυμα.

Το δεύτερο εργαλείο απέκλειε εντελώς το βήμα της διέλευσης. Η ομάδα προσέδεσε το κυανό της τολουϊδίνης O, μια στενά συγγενική χρωστική θειαζίνης, σε μια μεγάλη αλυσίδα πολυακρυλαμιδίου, υπερβολικά μεγάλη για να εισέλθει στο κύτταρο σε οποιαδήποτε κατάσταση οξείδωσης. Τα κύτταρα εξακολουθούσαν να ανάγουν την προσδεδεμένη χρωστική. Επομένως, η αναγωγή δεν απαιτεί πρόσβαση στο εσωτερικό του κυττάρου. Ο μηχανισμός είναι εκτεθειμένος στην επιφάνεια ή ηλεκτρικά συζευγμένος με αυτήν.

Έπειτα ήρθε ο διαχωρισμός που δίνει στην εργασία τον τίτλο της. Τα κυανιούχα και τα αζίδια σε συγκέντρωση 2 χιλιοστομοριακή κατέστειλαν έντονα τη συσσώρευση της χρωστικής και, στο μικροσκόπιο, τα σκούρα μπλε και μωβ έγκλειστα που συνήθως περιβάλλουν τον πυρήνα σχεδόν εξαφανίστηκαν. Ωστόσο, κανένας από τους δύο αναστολείς δεν επιβράδυνε την εξωκυτταρική αναγωγή: η ανακύκλωση του σιδηρικυανιούχου συνεχιζόταν αμείωτη και το μη διαπερατό πολυμερές εξακολουθούσε να ανάγεται. Η αναστολή εντοπιζόταν σε μεταγενέστερο στάδιο. Τα κυανιούχα και τα αζίδια σταματούσαν την ενδοκυτταρική επανοξείδωση και κατακράτηση, όχι την επιφανειακή αναγωγή. Οι έλεγχοι βιωσιμότητας υποστήριζαν αυτή την ερμηνεία, καθώς τα κύτταρα διατηρούσαν το κυτταροπλασματικό ένζυμο-δείκτη τους, τη γαλακτική αφυδρογονάση, κατά τις συγκεκριμένες παρεμβάσεις. Άρα, η απώλεια της πρόσληψης δεν οφειλόταν απλώς σε δηλητηρίαση ή ρήξη της μεμβράνης.

Μια επιφύλαξη της εργασίας εξακολουθεί να ισχύει. Τα μπλε έγκλειστα βρίσκονταν γύρω από τον πυρήνα, αλλά όχι μέσα σε αυτόν, κάτι συμβατό με οξείδωση στο εσωτερικό υποκυτταρικών οργανιδίων. Η μελέτη, όμως, δεν προσδιόρισε ποια ήταν αυτά τα οργανίδια. Παρόμοια πρότυπα σε άλλους τύπους κυττάρων είχαν χαρακτηριστεί λυσοσωμικά με ανεπαρκή τεκμηρίωση. Θεωρήστε την παγίδευση τεκμηριωμένη και τον ακριβή εντοπισμό της προσωρινό. Οι αναγνώστες που παρακολουθούν πού πηγαίνουν στη συνέχεια τα ηλεκτρόνια μπορούν να συνεχίσουν με τη μιτοχονδριακή μεταφορά ηλεκτρονίων και τις οξειδοαναγωγικές διεργασίες και την ευρύτερη εικόνα της απορρόφησης και κατανομής ανά οδό.

Η χρώση δεν ισοδυναμεί με την έκθεση

Μια τρίτη μελέτη δείχνει τι συμβαίνει όταν αυτός ο μηχανισμός πρόσληψης συνδέεται με έναν βιολογικό δείκτη. Ο Scott και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι η μεθυλο-βήτα-κυκλοδεξτρίνη, ένα σάκχαρο με σχήμα δακτυλιοειδούς τόρου, δεσμεύει απευθείας το κυανό του μεθυλενίου, με σταθερά σύνδεσης περίπου 310 ανά molar για το σύμπλοκο εγκλεισμού, έναντι περίπου 5846 ανά molar για τον διμερισμό της χρωστικής. Σε ινοβλάστες L929, αυτή η δέσμευση ανέστειλε τόσο την κυτταρική χρώση όσο και τη διέγερση της πρόσληψης γλυκόζης: η προεπώαση με την κυκλοδεξτρίνη απέτρεπε την μπλε χρώση, ενώ η προσθήκη της αργότερα επιτάχυνε την αποχρώση. Καθώς το οπτικό μπλε σήμα απομακρυνόταν από τα κύτταρα, η ενεργοποιημένη μεταφορά γλυκόζης υποχωρούσε σε στενή αντιστοιχία.

Οι συγγραφείς ερμήνευσαν αυτή τη συσχέτιση ως ένδειξη υπέρ μιας άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ της χρωστικής και μιας πρωτεΐνης στην οδό ενεργοποίησης του μεταφορέα γλυκόζης, αντί ενός μακρόβιου μηχανισμού οξειδωτικού στρες. Αυτό το συμπέρασμα είναι εύλογο, αλλά έχει όρια. Το πείραμα δεν προσδιορίζει την πρωτεΐνη, δεν δείχνει δέσμευση στον ίδιο τον μεταφορέα και η συσχέτιση μεταξύ αποχρώσης και απώλειας της επίδρασης δεν μπορεί να αποκλείσει κάθε οδό που μεσολαβείται από οξειδοαναγωγικές διεργασίες.

Το διαχρονικό δίδαγμα αφορά τη μέτρηση. Η οπτική χρώση αποτυπώνει ορατή, οξειδωμένη χρωστική που σχετίζεται με τα κύτταρα. Δεν ανιχνεύει καθόλου το άχρωμο, ανηγμένο απόθεμα, οπότε ένα ωχρά χρωματισμένο κύτταρο μπορεί να εξακολουθεί να περιέχει ισοδύναμα χρωστικής, ενώ ένα έντονα χρωματισμένο κύτταρο υποδηλώνει παγιδευμένη οξειδωμένη χρωστική και όχι τη συνολική έκθεση του ιστού ή το μέγεθος της επίδρασης. Η ίδια προσοχή απαιτείται και σε μεγαλύτερη κλίμακα: η σύγκριση της χρώσης μεταξύ τύπων κυττάρων ή η αντιμετώπιση μιας σκουρόχρωμης ιστολογικής τομής ως απόδειξης υψηλότερης έκθεσης επαναλαμβάνει το αρχικό σφάλμα της παρατήρησης στο τρυβλίο. Η πρόσληψη είναι ένας κύκλος αναγωγής, διάχυσης και επανοξείδωσης, και κάθε μεμονωμένο στιγμιότυπο της μπλε μορφής δείχνει μόνο μία πτυχή του. Οι πρακτικές συνέπειες για την εργαστηριακή χρώση και τον χειρισμό και για την ερμηνεία ισχυρισμών σχετικά με τη δόση και την έκθεση προκύπτουν άμεσα.