Χρώση με κυανό του μεθυλενίου: μέθοδοι μικροσκοπίας και άτλαντας πραγματικών εικόνων

Η χρώση με κυανό του μεθυλενίου διευκολύνει τη διάκριση κυτταρικών χαρακτηριστικών που διαφορετικά θα ήταν δυσδιάκριτα στη μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. Μπορεί να βοηθήσει τους μαθητές να εντοπίσουν τον πυρήνα ενός κυττάρου του στοματικού επιθηλίου ή να εξετάσουν το περίγραμμα και τη διάταξη μικροοργανισμών. Ωστόσο, ένα κυανό αντικείμενο αποτελεί παρατήρηση. Η ταυτοποίηση του οργανισμού, η μέτρησή του και η αξιολόγηση του αν υποδηλώνει νόσο είναι ξεχωριστές εργασίες.

Η εικόνα εξωφύλλου απεικονίζει την αρχή της αντίθεσης. Ο άτλαντας που ακολουθεί περιλαμβάνει πραγματικές φωτογραφίες από ανεξάρτητα τεκμηριωμένα δείγματα, μαζί με τις πληροφορίες της αρχικής πηγής τους.

Τι αναδεικνύει το κυανό του μεθυλενίου;

Το κυανό του μεθυλενίου είναι βασική χρωστική: το έγχρωμο ιόν του φέρει θετικό φορτίο. Όπως εξηγεί το OpenStax στην ενότητα για τη χρώση μικροσκοπικών δειγμάτων, οι βασικές χρωστικές αλληλεπιδρούν με αρνητικά φορτισμένο κυτταρικό υλικό και μπορούν να κάνουν τα κύτταρα να ξεχωρίζουν από ένα πιο ανοιχτόχρωμο υπόβαθρο. Σε κατάλληλα παρασκευάσματα, το κυανό του μεθυλενίου αναδεικνύει περιοχές πλούσιες σε νουκλεϊκά οξέα και άλλες δομές που δεσμεύουν τη χρωστική.

Στην απλή χρώση, μία χρωστική παρέχει αντίθεση. Επομένως, διαφορετικοί οργανισμοί μπορεί να εμφανίζονται κυανοί χωρίς να είναι ο ίδιος οργανισμός. Τα χρήσιμα ερωτήματα είναι αρχικά περιγραφικά: είναι τα αντικείμενα στρογγυλά ή επιμήκη, μεμονωμένα ή σε συσσωματώματα, ομοιόμορφα χρωματισμένα ή με εσωτερικές διαφοροποιήσεις; Δείτε τη διάκριση μεταξύ απλής χρώσης και χρώσης Gram προτού ερμηνεύσετε το χρώμα ως αποτέλεσμα ταξινόμησης.

Η αντίθεση και η διακριτική ικανότητα είναι διαφορετικές έννοιες. Η αντίθεση βοηθά να διακρίνουμε ένα αντικείμενο από το περιβάλλον του· η διακριτική ικανότητα επιτρέπει τον διαχωρισμό γειτονικών λεπτομερειών. Μια πιο σκούρα εικόνα δεν εγγυάται ότι διακρίνονται περισσότερες δομές. Ούτε κάθε σκούρο κοκκίο δικαιολογεί τον χαρακτηρισμό του ως οργανιδίου.

Φυσικά παρασκευάσματα, χρωματισμένα νωπά παρασκευάσματα και επιχρίσματα

Ένα νωπό παρασκεύασμα χωρίς χρώση, ή φυσικό παρασκεύασμα, διατηρεί μια εικόνα χωρίς προσθήκη χρωστικής, αν και η απομάκρυνση από το αρχικό περιβάλλον εξακολουθεί να μεταβάλλει το δείγμα. Σε ένα χρωματισμένο νωπό παρασκεύασμα προστίθεται αντιδραστήριο, ενώ το υλικό παραμένει σε υγρό κάτω από μια καλυπτρίδα. Για ένα μονιμοποιημένο επίχρισμα, το υλικό απλώνεται σε αντικειμενοφόρο πλάκα και εφαρμόζεται μια καθορισμένη μέθοδος μονιμοποίησης πριν από την περαιτέρω επεξεργασία. Η επισκόπηση του OpenStax για την παρασκευή δειγμάτων διακρίνει τα νωπά παρασκευάσματα από τη μονιμοποίηση και εξηγεί γιατί οι μονιμοποιημένοι οργανισμοί δεν προσφέρουν πλέον εικόνα της φυσιολογικής κίνησης ή του μεταβολισμού τους.

Αυτά τα παρασκευάσματα απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα:

Για μια σύγκριση στην τάξη, καταγράψτε ένα παρασκεύασμα χωρίς χρώση πριν εξετάσετε ένα ξεχωριστό χρωματισμένο παρασκεύασμα που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το διδακτικό πρωτόκολλο. Διατηρήστε συγκρίσιμες τις ρυθμίσεις φωτισμού και λήψης εικόνας. Αν φωτογραφίζονται δύο διαφορετικά κύτταρα, περιγράψτε τα ως παραδείγματα και όχι ως καταγραφή του ίδιου κυττάρου πριν και μετά τη χρώση.

Άτλαντας μικροσκοπίας: τρία πραγματικά χρωματισμένα δείγματα

Αυτός ο άτλαντας αποτελεί πρωτότυπη επιλογή και ερμηνεία τριών μικροφωτογραφιών με ανοικτές άδειες χρήσης. Οι δημιουργοί των αρχικών εικόνων προσδιορίζουν τα δείγματα και τις χρωστικές. Δεν έχουμε επαληθεύσει ανεξάρτητα την ταυτότητα των δειγμάτων τους. Οι εικόνες αναπαράγονται χωρίς περικοπή, ως μετατροπές σε WebP χωρίς απώλειες, χωρίς προσθήκη χαρακτηριστικών ή αλλαγές χρώματος.

Εικόνα 1: ανθρώπινα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου

Δείγμα: ανθρώπινα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου. Χρωστική: κυανό του μεθυλενίου. Μεγέθυνση: 400×, όπως αναφέρεται από τον φωτογράφο. Γραμμή κλίμακας: μη διαθέσιμη· η πηγή δεν παρέχει βαθμονομημένο μέγεθος εικονοστοιχείου. Φωτογραφία του Fritzmann2002, 2017, από το Ανθρώπινα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου (χρώση με κυανό του μεθυλενίου), με άδεια CC BY-SA 4.0. Η παρούσα αναπαραγωγή διατηρεί αυτή την άδεια.

Ξεκινήστε από ένα μεμονωμένο κύτταρο: ο σκουρότερος πυρήνας του διακρίνεται ευκολότερα από το κυανό κυτταρόπλασμα που τον περιβάλλει. Έπειτα εξετάστε τα επικαλυπτόμενα κύτταρα από κάτω του. Η επικάλυψη δυσκολεύει την παρακολούθηση ενός ορίου και μπορεί να δημιουργήσει μια τοπικά σκουρότερη περιοχή. Χρησιμοποιήστε αυτή την εικόνα για να εξασκηθείτε στην ιχνηλάτηση περιγραμμάτων, όχι για να μετράτε κάθε σκούρα κηλίδα ως πυρήνα. Ο οδηγός παρατήρησης κυττάρων του στοματικού επιθηλίου αναπτύσσει την άσκηση για το συγκεκριμένο δείγμα.

Εικόνα 2: κύτταρα κρεμμυδιού

Δείγμα: κύτταρα κρεμμυδιού, όπως προσδιορίζονται από την πηγή. Χρωστική: κυανό του μεθυλενίου. Μεγέθυνση: το “200x” εμφανίζεται στο αρχικό όνομα αρχείου· δεν έχει επαληθευτεί ανεξάρτητα. Γραμμή κλίμακας: μη διαθέσιμη· δεν παρέχεται βαθμονόμηση. Φωτογραφία του Alvy16, 2019, από το Κύτταρο κρεμμυδιού 200x, με άδεια CC BY 4.0.

Τα επιμήκη διαμερίσματα σχηματίζουν ένα οργανωμένο στρώμα. Συγκρίνετε τα μακριά κοινά όριά τους με τα ακανόνιστα περιγράμματα στην Εικόνα 1. Παρατηρήστε επίσης το έντονα ορατό σκούρο υλικό και την ανομοιόμορφη φωτεινότητα του πεδίου. Η φωτογραφία δεν τεκμηριώνει την ταυτότητα κάθε σκούρας εναπόθεσης. Δείχνει γιατί μια χρήσιμη καταγραφή παρατήρησης περιλαμβάνει τεχνουργήματα και αβεβαιότητα, αντί να αποδίδει ταυτότητα σε οτιδήποτε προσλαμβάνει χρώμα.

Εικόνα 3: ζυμομύκητες που προσδιορίζονται από την πηγή ως Candida spp.

Δείγμα: Candida spp., σύμφωνα με τη φωτογράφο. Χρώση: απλή θετική χρώση με κυανό του μεθυλενίου. Μεγέθυνση: μη διαθέσιμη. Γραμμή κλίμακας: μη διαθέσιμη· δεν παρέχεται βαθμονομημένο μέγεθος εικονοστοιχείου. Φωτογραφία της Marta, χρήστριας του Wikimedia με το όνομα Martunia.g, 2021, από το Θετική χρώση με κυανό του μεθυλενίου 2, με άδεια CC BY 4.0.

Συγκρίνετε τα πυκνά κυανά συσσωματώματα με τις λιγότερο πυκνές παρυφές. Τα μεμονωμένα περιγράμματα παρακολουθούνται ευκολότερα εκεί όπου τα αντικείμενα επικαλύπτονται λιγότερο. Το όνομα Candida προέρχεται από την καταγραφή της πηγής και όχι από ταυτοποίηση είδους που πραγματοποιήθηκε με βάση αυτή τη φωτογραφία. Η εικόνα αυτή δεν παρέχει επίσης αποτέλεσμα βιωσιμότητας. Οι δοκιμασίες βιωσιμότητας και αναπνοής ζυμομυκήτων απαιτούν τις δικές τους συνθήκες, μάρτυρες και ερμηνεία.

Σωστή ανάγνωση της κλίμακας

Αυτές οι εικόνες υποστηρίζουν την οπτική σύγκριση, όχι μετρήσεις σε μικρόμετρα ή συγκρίσεις του απόλυτου μεγέθους των κυττάρων μεταξύ εικόνων. Η αναφερόμενη μεγέθυνση δεν αναπληρώνει τη βαθμονόμηση της κάμερας που λείπει. Η αλλαγή του μεγέθους προβολής μιας εικόνας αλλάζει τη φαινομενική μεγέθυνσή της.

Για τις δικές σας εικόνες, πραγματοποιήστε βαθμονόμηση μέτρησης χρησιμοποιώντας ένα γνωστό πρότυπο και την αντίστοιχη οπτική διάταξη. Ο οδηγός της Nikon για τη μικρομετρία εξηγεί πώς ένα μικρόμετρο αντικειμενοφόρου μετατρέπει αυθαίρετες υποδιαιρέσεις της εικόνας ή του δικτυώματος σε φυσικά μήκη. Καταγράψτε τον αντικειμενικό φακό, τη διαμόρφωση της κάμερας και τη βαθμονόμηση και προσθέστε μια γραμμή κλίμακας με βάση αυτά τα δεδομένα. Μην υπολογίζετε μια γραμμή κλίμακας από το μέσο μέγεθος κυττάρου που αναφέρει ένα εγχειρίδιο.

Ταιριάζει το περιεχόμενο της φιάλης στη μέθοδο;

Μια φιάλη με την ένδειξη κυανό του μεθυλενίου δεν αποτελεί πλήρη εργαστηριακή προδιαγραφή. Ελέγξτε τη συγκέντρωση και τις μονάδες της, τον διαλύτη, τα πρόσθετα συστατικά, την προβλεπόμενη εφαρμογή, την τεκμηρίωση της παρτίδας και τις οδηγίες. Το δελτίο δεδομένων ασφαλείας ενός αντιδραστηρίου περιγράφει τους κινδύνους· οι οδηγίες της μεθόδου καθορίζουν πώς χρησιμοποιείται για το προβλεπόμενο παρασκεύασμα.

Ένα συγκεκριμένο παράδειγμα είναι το διάλυμα κυανού του μεθυλενίου κατά Löffler της Merck. Ο κατασκευαστής το χαρακτηρίζει ως αντιδραστήριο μικροσκοπίας και περιγράφει τον ρόλο του ως αντιχρωστικής στην οξεάντοχη χρώση. Η αναφερόμενη ευφλεκτότητά του δείχνει επίσης γιατί η περιγραφή «ένα κυανό υγρό» δεν επαρκεί για τον σχεδιασμό του χειρισμού ή της θέρμανσης. Αυτές οι ιδιότητες αφορούν τη συγκεκριμένη σύνθεση και δεν ισχύουν αυτομάτως για κάθε υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου.

Ομοίως, το άγαρ ηωσίνης και κυανού του μεθυλενίου είναι ένα καλλιεργητικό μέσο με καθορισμένη σύνθεση. Δεν είναι χρωστικό παρασκεύασμα αντικειμενοφόρου που προκύπτει με την προσθήκη απλού κυανού του μεθυλενίου σε ένα δείγμα. Για διαφορετικό στόχο απεικόνισης, συγκρίνετε εναλλακτικές του κυανού του μεθυλενίου για τη μικροσκοπία.

Για ένα κιτ μικροσκοπίας αρχαρίων, ξεκινήστε με την τεκμηριωμένη εκπαιδευτική μέθοδό του, έτοιμα παρασκευάσματα γνωστής ταυτότητας και το καθορισμένο αντιδραστήριο. Αν μια φιάλη έχει χάσει την ετικέτα της ή δεν μπορεί να προσδιοριστεί η σύνθεσή της, αντικαταστήστε την με το κατάλληλο τεκμηριωμένο αντιδραστήριο. Χρησιμοποιείτε προστασία ματιών και ακολουθείτε τις οδηγίες χειρισμού που παρέχονται για τη συγκεκριμένη σύνθεση. Το ανθρώπινο υλικό και τα άγνωστα περιβαλλοντικά δείγματα απαιτούν τις διαδικασίες χειρισμού και απόρριψης δειγμάτων του εκπαιδευτικού εργαστηρίου· η χρώση δεν υποκαθιστά αυτές τις διαδικασίες.

Καταγράψτε την παρατήρηση πριν από το συμπέρασμα

Η φράση «κυανά ωοειδή αντικείμενα σε συσσωματώματα» είναι μια τεκμηριώσιμη περιγραφή μιας εικόνας. Η φράση «μια συγκεκριμένη λοίμωξη» απαιτεί στοιχεία που η εικόνα δεν έχει παράσχει. Κρατήστε χωριστά στο εργαστηριακό ημερολόγιο την προέλευση του δείγματος, την παρασκευή, την αντίδραση χρώσης και τη μέθοδο ταυτοποίησης. Αυτή η διάκριση καθιστά χρήσιμη μια απλή εικόνα από την τάξη και αποτρέπει την απόδοση σε μια ελκυστική μικροφωτογραφία ενός ισχυρισμού που δεν μπορεί να υποστηρίξει.