Kann Methylenblau den mitochondrialen Komplex III umgehen? Warum Studien zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen

Zwei Labore untersuchten, ob Methylenblau einen blockierten mitochondrialen Komplex III umgehen kann. Das eine antwortete mit Nein. Das andere mit Ja. Beide hatten Daten.

Die erste Studie an Mitochondrien aus Mäusegehirnen ergab, dass der Farbstoff dazu nicht in der Lage ist. Die zweite Studie an Gehirnmitochondrien dreier Nagetierarten ergab, dass er es teilweise kann. Eine dritte Studie an Mäuselebern wird häufig in diesem Zusammenhang zitiert, untersuchte aber etwas anderes. Ordnet man sie richtig ein, löst sich die Hälfte der Verwirrung auf.

Ein universeller Mechanismus lässt sich daraus nicht ableiten. Es handelt sich um drei Experimente mit unterschiedlichen Blockern, Konzentrationen und Messgrößen. Zuerst müssen die Bedingungen betrachtet werden. Daraus ergeben sich die Schlussfolgerungen.

Was Umgehung hier bedeutet

Elektronen gelangen über Komplex I (aus NADH) oder Komplex II (aus Succinat) in die Kette, passieren Komplex III auf dem Weg zu Cytochrom c und gelangen dann über Komplex IV zum Sauerstoff. Den dabei aufgebauten Gradienten nutzt die Zelle zur Herstellung von ATP.

Die Behauptung einer Umgehung besagt, dass Methylenblau Elektronen vor einer Blockade aufnimmt und hinter ihr wieder abgibt. Der oxidierte Farbstoff nimmt Elektronen von NADH oder frühen Komponenten der Kette auf und wird dabei zu Leukomethylenblau. Die reduzierte Form überträgt sie auf Cytochrom c oder zurück in die Kette. Erfolgt die Übergabe hinter der Blockade, erholen sich Atmung und Membranpotenzial teilweise. Erfolgt sie an der Blockade oder davor, erholt sich nichts.

Ein Detail von Komplex III ist für einen großen Teil dieser Kontroverse entscheidend. Der Komplex durchläuft einen Q-Zyklus mit zwei Bindungsstellen für Inhibitoren. Antimycin bindet an die Qi-Stelle. Myxothiazol bindet an die Qo-Stelle. Eine Studie, die nur einen dieser Inhibitoren verwendet, hat nur die Hälfte des Komplexes geprüft.

Studie eins: keine Umgehung in Mitochondrien aus Mäusegehirnen

Gureev und Kollegen verwendeten Mitochondrien aus der Hirnrinde von C57BL/6-Mäusen, die mithilfe von Digitonin isoliert und bei 0.1 mg Protein pro ml untersucht wurden. Die Substrate deckten drei Bedingungen ab: Pyruvat plus Malat mit jeweils 5 mM, Succinat mit 10 mM zusammen mit Glutamat mit 2 mM sowie L-Prolin mit 10 mM. Als Blocker dienten Rotenon mit 1 micromolar (Komplex I) und Antimycin mit 1 microgram pro ml (Komplex III). Die Farbstoffkonzentrationen betrugen 0.5, 1 und 2 micromolar, wobei 1 micromolar die Hauptkonzentration war. Methoden und Messkurven finden sich in der Kurzmitteilung in FEBS Letters.

Die Umgehung von Komplex I funktionierte. Rotenon senkte die ADP-stimulierte Atmung von etwa 121 auf etwa 2 nmol pro Minute und mg, und 1 micromolar Farbstoff erhöhte sie wieder auf etwa 21. Das Membranpotenzial erholte sich mit Pyruvat plus Malat und mit L-Prolin.

Die Umgehung von Komplex III funktionierte nicht. Antimycin senkte die Atmung auf etwa 16, und der Farbstoff erhöhte sie lediglich auf etwa 20. Bei keinem Substrat erholte sich das Membranpotenzial, auch nicht bei Farbstoffkonzentrationen bis zu 5 micromolar. Die Peroxiddaten deuteten in dieselbe Richtung: Der Farbstoff allein erhöhte die Peroxidfreisetzung von einer Basalrate nahe 76 pmol pro Minute und mg auf ungefähr 1170, 1460 und 1945 bei den drei Konzentrationen. Antimycin senkte dieses farbstoffbedingte Signal jedoch um etwa 25, 88 beziehungsweise 96 Prozent. Würde der reduzierte Farbstoff direkt mit Sauerstoff reagieren, dürfte eine Blockade von Komplex III das Signal nicht unterdrücken. Die Autoren schlossen daraus, dass der reduzierte Farbstoff an der Qo-Stelle von Komplex III oxidiert wird, vor der Antimycinblockade. Der kurze Kreislauf in Worten: von den Elektronendonoren zum Farbstoff, vom Farbstoff zu Qo, dann weiter auf dem normalen Weg. Rotenon wird umgangen. Antimycin nicht.

Studie zwei: teilweise Umgehung bei drei Arten und an beiden Inhibitorstellen

Svab und Kollegen erweiterten den Versuchsaufbau. Sie verwendeten Gehirnmitochondrien von Mäusen, Ratten und Meerschweinchen, die mithilfe von Percoll isoliert und bei denselben 0.1 mg pro ml untersucht wurden, mit Pyruvat plus Malat oder Glutamat plus Malat bei jeweils 5 mM. Sie setzten zwei Blocker von Komplex III ein: Antimycin A mit 0.3 micromolar und Myxothiazol mit 1 micromolar. Die Farbstoffkonzentration betrug in den meisten Versuchen 2 micromolar, bei den Untersuchungen zu Cytochrom c 0.5. Die Untersuchungen aller drei Arten mit aufeinander abgestimmten Protokollen finden sich in der frei zugänglichen Veröffentlichung.

Beide Blockaden wurden bei allen drei Arten teilweise umgangen. In Mäusemitochondrien unterdrückte Antimycin die Atmung, und der Farbstoff erhöhte sie um etwa 60 Prozent, von ungefähr 37 auf 59 nmol pro Minute und mg. Myxothiazol unterdrückte sie um 88 Prozent auf etwa 4.5, und der Farbstoff erhöhte sie auf das Fünffache, auf etwa 23. Unter beiden Inhibitoren kam es zu einer teilweisen Repolarisierung des Membranpotenzials. Gemessen wurde mit zwei Farbstoffen (Safranin O und ratiometrischem TMRM), um optische Artefakte auszuschließen.

Diese Veröffentlichung untersuchte außerdem die Elektronenübergabe direkt, was die erste Studie nie getan hatte. Exogenes acetyliertes Cytochrom c mit 25 micromolar wurde von energetisierten Mitochondrien weder mit noch ohne Inhibitoren reduziert. Die Zugabe des Farbstoffs bewirkte jedoch in beiden Fällen eine Reduktion. In zellfreiem Puffer reduzierte NADH zusammen mit dem Farbstoff Cytochrom c mit einer zu NADH proportionalen Rate. Der längere Sprung in Worten: Reduktionsäquivalente zum Farbstoff, vom Farbstoff direkt zu Cytochrom c, über Komplex IV zum Sauerstoff. Dieser Weg überspringt Komplex III vollständig, sodass sich beide Blocker umgehen lassen.

Zwei weitere Messgrößen stützen diese Interpretation. Die NAD(P)H-Fluoreszenz nahm ab, wenn der Farbstoff zu mit Myxothiazol behandelten Mitochondrien gegeben wurde. Das bedeutet, dass Reduktionsäquivalente über den neuen Weg abflossen. Zudem folgte die Farbstoffabsorbanz bei 660 nm jeder Zugabe, während die nach Zentrifugation gewonnenen Überstände zeigten, dass sich oxidierter Farbstoff in energetisierten Mitochondrien um mehr als das Hundertfache anreicherte und sie wieder verließ, sobald das Potenzial zusammenbrach. Auch die Protonenbilanz passt dazu: Durch das Überspringen der Pumpenschritte verbleiben ungefähr 2 Protonen pro Elektronenpaar statt 10. Ein schnellerer Sauerstoffverbrauch bei nur teilweiser Repolarisierung entspricht daher dem erwarteten Bild einer tatsächlichen Umgehung und ist kein Gegenbeleg.

Dieselbe Präparation zeigte Reaktionen, die bei oberflächlicher Lektüre leicht falsch eingeordnet werden. Bei Inhibitor plus Farbstoff senkte ADP die Atmung, statt sie zu erhöhen, und eine Transportblockade stimulierte sie, statt sie zu verlangsamen. Das Membranpotenzial veränderte sich dabei weiterhin in den üblichen Richtungen. Der Sauerstoffverbrauch allein führt in diesem System in die Irre.

Studie drei: die Leberstudie, die die Komplexe I und II untersuchte, nicht III

Lee und Boelsterli verwendeten Mitochondrien aus Mäuselebern und kultivierte Hepatozyten, die durch Efavirenz (Komplex I, IC50 nahe 30 micromolar) und Hydrazin, den Isoniazidmetaboliten (Komplex II, IC50 nahe 30 micromolar), geschädigt wurden. Der Farbstoff stellte bei etwa 30 micromolar die NADH-Oxidation, das Membranpotenzial und ATP wieder her und verringerte gleichzeitig Oxidantien und nekrotischen Zelltod. Die Veröffentlichung in Redox Biology beschreibt dies in ihrem Modell als einen Elektronentransport durch den Farbstoff, der die geschädigten Komplexe I und II umgeht.

Dieses Ergebnis liefert einen geklärten Kontext zu den vorgelagerten Komplexen. Es sagt nichts über Komplex III aus, weil dieser in der Studie nicht blockiert wurde. Es kann keine der beiden Gehirnstudien bestätigen oder widerlegen.

Die Matrix der Versuchsbedingungen

Vier Gründe, warum beide Studien zu Komplex III für ihren jeweiligen Versuchsaufbau richtig sein können

1. Die Blocker stellten nicht denselben Eingriff dar. Antimycin allein mit 1 microgram pro ml gegenüber Antimycin mit 0.3 micromolar und einem separaten Blocker der Qo-Stelle. Ein Farbstoffweg, der Elektronen in die Qo-Stelle einspeist, scheitert genau dort, wo ein direkter Weg zu Cytochrom c funktioniert. Eine Stelle kann nicht für beide stehen.

2. Farbstoffkonzentration und Zeitablauf unterschieden sich. Die Hauptkonzentrationen betrugen 1 beziehungsweise 2 micromolar bei einer redoxzyklierenden Substanz, deren Aufnahme und direkte Reduktion von Cytochrom c konzentrations- und zeitabhängig sind. Kleine Konzentrationsunterschiede und unterschiedliche Messzeitpunkte können verschiedene Abschnitte desselben Netzwerks sichtbar machen.

3. Die Präparationen unterschieden sich. Eine Isolierung mit Digitonin und eine Isolierung über einen Percoll-Gradienten wählen überlappende, aber nicht identische Mitochondrienpopulationen aus. Die Proteinkonzentration war mit 0.1 mg pro ml gleich, sodass diese Variable entfällt. Unterschiede in Subpopulation und Integrität bleiben jedoch bestehen. Ein Artenunterschied schied als Erklärung aus: Die zweite Gruppe reproduzierte ihr beobachtetes Verhalten auch bei Mäusen.

4. Die Substratbedingungen bestimmen, was der Farbstoff tun kann. Drei Substratbedingungen standen NADH-gekoppelten Substratpaaren gegenüber. NADH-Verfügbarkeit und Membranpotenzial bestimmen gemeinsam, wie schnell der Farbstoff reduziert wird und wie er sich verteilt. Ein Weg, der reduzierten Farbstoff neben oxidiertem Cytochrom c benötigt, hängt von dieser Wahl ab.

Wie sich die nächste Behauptung einer Umgehung beurteilen lässt

Fragen Sie, welcher Komplex blockiert wurde, mit welchem Inhibitor, an welcher Stelle und bei welcher Konzentration. Fragen Sie nach der Farbstoffkonzentration und dem Messzeitpunkt. Fragen Sie nach Gewebe, Art, Isolierung, Proteinkonzentration und Substrat. Prüfen Sie außerdem, ob Potenzial, Atmung, Redoxzustand und ein Assay zur direkten Elektronenübergabe übereinstimmen, denn der Sauerstoffverbrauch allein führte hier mehr als einmal zu einer falschen Interpretation.

Die eng gefasste Zusammenfassung bleibt gültig. Die Umgehung von Komplex I durch den Farbstoff ist unstrittig. Bei Komplex III zeigen Mäusemitochondrien mit Antimycin bei 1 microgram pro ml und Farbstoff bei 1 micromolar keine funktionelle Umgehung. Dagegen zeigen drei Arten mit Antimycin bei 0.3 micromolar oder Myxothiazol bei 1 micromolar und Farbstoff bei 2 micromolar eine teilweise Umgehung mit direkter Elektronenübertragung vom Farbstoff auf Cytochrom c. Diese Aussagen sind miteinander vereinbar. Alles, was darüber hinausgeht, ist eine Extrapolation.

Weiterführende Lektüre ordnet die umstrittene Behauptung in unstrittige chemische Zusammenhänge ein: wie Methylenblau Elektronen bewegt erläutert die Elektronenweitergabe, die Experimente zur Umgehung von Komplex I behandeln den geklärten Fall am vorgelagerten Komplex, Messungen des Membranpotenzials und ihre Artefakte erklären, warum zwei Farbstoffe nötig waren, und der Umgang mit redoxzyklierenden Substanzen im Labor erklärt die Fallstricke bei Konzentration und Zeitablauf.