Warum sich die Absorption von Methylenblau mit der Konzentration verändert

Nehmen Sie eine Flasche mit einer Methylenblau-Stammlösung und füllen Sie zwei Gläser. Füllen Sie das erste mit der Stammlösung und das zweite mit einer zehnfachen Verdünnung. Das zweite Glas ist erwartungsgemäß blasser. Bei genauerem Hinsehen hat sich noch etwas verändert: Der Farbton hat sich verschoben. Eine Lösung erscheint eher klar himmelblau, die andere eher blau mit einem violetten Stich. Die Verdünnung hat mehr bewirkt als eine geringere Intensität. Sie hat verändert, welche chemische Spezies den größten Anteil an der Absorption hat.

Das Prinzip hinter dieser Verschiebung ist einfach. Gelöstes Methylenblau liegt nicht als eine einzige Spezies vor. Das einzelne Farbstoffkation, das sogenannte Monomer, kann sich mit einem zweiten Kation flächig übereinanderlagern und ein Dimer bilden. Dimere können sich zu größeren Aggregaten zusammenschließen. Jede Form hat ihr eigenes Absorptionsspektrum. Ein Spektrophotometer erfasst die Summe der Beiträge des Gemischs, das unter den jeweiligen Bedingungen in der Küvette vorliegt. Ändert sich die Zusammensetzung des Gemischs, verschiebt sich das Spektrum, selbst wenn der Gesamtfarbstoffgehalt einem einfachen Verdünnungsverhältnis folgt.

Monomer und Dimer absorbieren unterschiedlich

Stellen Sie sich das Monomer als flache Karte vor, deren positive Ladung über das Ringsystem verteilt ist. Zwei solcher Karten können sich flächig übereinanderlagern. Die positiven Ladungen stoßen sich ab, doch die flachen aromatischen Oberflächen ziehen sich durch Stapelwechselwirkungen an. Das umgebende Wasser und die Gegenionen schirmen die Abstoßung ab. Das Ergebnis ist ein gebundenes Paar mit gemeinsamen elektronischen Zuständen. Seine erlaubten Übergänge liegen bei höherer Energie als der Monomerübergang. Daher erscheint die Dimerbande bei kürzerer Wellenlänge als die Monomerbande. Größere Aggregate tragen weiter auf der blauen Seite des Spektrums in Form einer Schulter bei.

Bei sehr niedriger Konzentration in sauberem Wasser überwiegen die Monomere und damit die langwellige Bande. Mit steigender Gesamtkonzentration nimmt der Anteil der gepaarten Form zu, und die kurzwellige Bande wächst relativ zur ersten. Das Verhältnis der beiden Banden beschreibt daher die Zusammensetzung des Gemischs, nicht unmittelbar die Gesamtkonzentration. Eine Messung bei einer einzigen Wellenlänge kann die beiden Beiträge nur dann trennen, wenn eine Annahme darüber getroffen wird, welche Form vorliegt.

Deshalb gehören die Messbedingungen immer zu einem Referenzspektrum. Die Spektralreferenz für Methylenblau führt die Bandenpositionen zusammen mit dem Lösungsmittel, dem Salzgehalt, dem pH-Wert, der Temperatur und dem Konzentrationsbereich auf, unter denen sie ermittelt wurden. Wird ein Absorptionsmaximum ohne diese Bedingungen angegeben, ist die Zahl unzureichend beschrieben. Zwei Labore können für denselben Farbstoff unterschiedliche Spektren korrekt angeben, weil sie unterschiedliche Gemische gemessen haben.

Was das Gleichgewicht verschiebt

Die Konzentration ist der wichtigste Einflussfaktor. Für die Dimerbildung müssen zwei Monomere aufeinandertreffen. Deshalb steigt der Dimeranteil stärker als linear mit der Gesamtfarbstoffkonzentration. Veröffentlichte Dimerisierungskonstanten in Wasser liegen nahe Raumtemperatur im Bereich von mehreren Tausend pro molar. Der Dimeranteil steigt daher im mikromolaren Bereich steil an. Eine umfassende globale Anpassung über Farbstoffkonzentrationen vom mikromolaren bis zum millimolaren Bereich ergab bereits unterhalb von 34 mikromolar einen Tetramerbeitrag größer als null. Das zeigt, dass eine strikt auf zwei Spezies beschränkte Anpassung bei einigen Zehn mikromolar nicht ohne Weiteres verlässlich ist. Die genauen Anteile hängen vom Medium ab. Deshalb beschreibt dieser Artikel die Richtung der Veränderungen, statt eine universelle Umrechnungstabelle anzugeben.

Salz ist der zweite Einflussfaktor. Gelöste Ionen schirmen die Abstoßung zwischen zwei Kationen ab. Zugesetztes Natriumchlorid und ähnliche Elektrolyte verschieben das Gemisch deshalb bei gleicher Farbstoffkonzentration in Richtung Dimere und Aggregate. Dieser Effekt zeigt sich in Studien zur Aggregation von Methylenblau in salzhaltigen und wässrigen Medien. Dort wurden Farbstoffkonzentrationen von etwa 1 mikromolar bis 3.4 millimolar bei Natriumchloridkonzentrationen von 0 bis 0.15 molar gemessen. Bei dieser Anpassung erreichte der Tetrameranteil unter den Bedingungen mit hoher Farbstoff- und hoher Salzkonzentration etwa 0.93. Ein in Wasser aufgenommenes Spektrum und ein in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommenes Spektrum sind daher keine austauschbaren Referenzen.

Die Temperatur wirkt in die andere Richtung. Bei der Stapelbildung wird gebundenes Wasser freigesetzt, während die thermische Bewegung der Stapelbildung entgegenwirkt. Beim Erwärmen einer Lösung dissoziiert deshalb typischerweise ein Teil der Dimere wieder zu Monomeren, während Abkühlen die Assoziation begünstigt. Die durch Anpassung ermittelte Dissoziationsenthalpie ist negativ und beträgt über den Bereich von 282 bis 333 kelvin etwa minus 30 Kilojoule pro Mol, was die exotherme Assoziation bestätigt. Eine kalte Probe, die unmittelbar nach der Entnahme aus dem Kühlschrank gemessen wird, kann stärker aggregiert erscheinen als dieselbe Probe nach der Angleichung an die Raumtemperatur.

Das Lösungsmittel bestimmt die Ausgangslage. Wasser begünstigt durch seinen starken hydrophoben Effekt die Stapelbildung der flachen Farbstoffkationen. Alkohole wie Ethanol und Methanol solvatisieren die Ringe besser und lösen Aggregate auf. Deshalb liegt der Farbstoff bei gleicher Konzentration in Ethanol stärker als Monomer vor als in Wasser. Aprotische Cosolventien wirken ähnlich: In Wasser-DMSO-Gemischen bei 293 kelvin unterdrückte zugesetztes DMSO die Dimerisierung. Das weist darauf hin, dass die Wasserstruktur die Stapelbildung antreibt. Bei Tensiden müssen beide Wirkrichtungen berücksichtigt werden. Oberhalb ihrer kritischen Mizellkonzentration können Mizellen Monomere einzeln solubilisieren und ein monomerähnliches Spektrum wiederherstellen. Unterhalb dieses Punkts kann ein entgegengesetzt geladenes Tensid dagegen die Stapelbildung fördern: Bei 100 mikromolar Farbstoff erreichte die durch SDS ausgelöste Polymerisation ihr Maximum bei etwa 4 millimolar SDS, ungefähr der Hälfte der kritischen Mizellkonzentration. Bei höheren Tensidkonzentrationen kam es zu einer Umverteilung. Arbeiten zu Einflüssen von Farbstoff-Lösungsmittel-Wechselwirkungen und organisierten Medien auf Methylenblau-Spektren zeigen, wie stark die unmittelbare molekulare Umgebung und nicht allein die Gesamtkonzentration die beobachteten Banden bestimmt.

Der pH-Wert spielt vor allem in den Randbereichen eine Rolle. Im annähernd neutralen Bereich, der bei den meisten Laborarbeiten verwendet wird, bleibt Methylenblau in seiner bekannten kationischen blauen Form. Die Aggregation bestimmt dann überwiegend das spektrale Verhalten. Starke Säuren oder Basen, Redoxreaktionen, die die farblose Leukoform erzeugen, sowie die Bindung an Proteine und Partikel führen jeweils weitere Zustände ein, die über das Monomer-Dimer-Paar hinausgehen. Wenn sich ein Spektrum nach der Zugabe eines Puffers verändert, prüfen Sie die Pufferzusammensetzung auf Salze und bindende Komponenten, bevor Sie alles allein dem pH-Wert zuschreiben. Die Referenz zu Chemie und Protonierung behandelt diese Fragen zur chemischen Identität getrennt von der hier betrachteten Aggregation.

Warum die Gerade des Lambert-Beer-Gesetzes gekrümmt wird

Nach dem Lambert-Beer-Gesetz ist die Absorbanz gleich dem Produkt aus Absorptionskoeffizient, Konzentration und Schichtdicke. Es ist ein Zählgesetz. Es setzt voraus, dass die gezählten Objekte bei veränderter Anzahl identisch bleiben: eine absorbierende Spezies, ein konstantes Spektrum, keine konzentrationsabhängigen chemischen Veränderungen, monochromatisches Messlicht, keine Streuung oder Reemission und Licht, das tatsächlich die angegebene Strecke durchläuft.

Aggregation verletzt die erste Annahme. Formal bleibt die Gesamtabsorbanz eine Summe über die Spezies: die Schichtdicke multipliziert mit dem jeweiligen Absorptionskoeffizienten und der Konzentration der jeweiligen Spezies. Jede Spezies folgt dem Gesetz. Das Gemisch tut dies nicht, weil die Spezieskonzentrationen nichtlineare Funktionen der Gesamtfarbstoffkonzentration sind. Eine Kalibrierkurve der Absorbanz an der Monomerbande gegen die Gesamtfarbstoffkonzentration beginnt deshalb im stark verdünnten Bereich geradlinig und krümmt sich mit steigender Konzentration nach unten. Jeder weitere Konzentrationszuwachs bringt proportional weniger Monomer hinzu. Eine an der Dimerbande gemessene Kurve krümmt sich in die andere Richtung. Arbeiten zur Aggregation benennen genau diesen Mechanismus als Ursache der beobachteten Abweichungen vom Lambert-Beer-Gesetz. Eine Gerade an den gekrümmten Bereich anzupassen und sie zu extrapolieren, ist der typische Fehler. Die Gerade gilt nur innerhalb des Bereichs und der Matrix, in denen sie erstellt wurde.

Verdünnung führt zu einer verwandten Fehlerquelle. Wird eine konzentrierte Stammlösung verdünnt, um in den Messbereich des Geräts zu gelangen, bleibt das Speziesverhältnis nicht erhalten. In der verdünnten Küvette stellt sich das Gleichgewicht neu in Richtung Monomer ein. Ihr Spektrum beschreibt daher die verdünnte Probe korrekt, die Stammlösung jedoch falsch. Wird das Spektrum der Stammlösung durch Hochskalieren der Absorbanzwerte zurückgerechnet, ergibt sich nur dann eine korrekte Schätzung des Gesamtgehalts, wenn die Kalibrierung die Verschiebung bereits berücksichtigt. Die ursprüngliche Bandenform lässt sich dadurch niemals wiederherstellen. Wer das Spektrum eines Konzentrats mit einer verdünnten Referenz vergleicht, vergleicht zwei unterschiedliche Gemische.

Die Schichtdicke ist Teil des Ergebnisses

Die Absorbanz skaliert mit der Strecke, die das Licht durch die Probe zurücklegt. Eine 10 mm-Küvette liefert die zehnfache Absorbanz einer 1 mm-Küvette mit derselben Lösung. Diese Skalierung gilt exakt nur für dieselbe Lösung. Durch die Aggregation wird diese Einschränkung entscheidend.

In der Praxis dient die Schichtdicke dazu, innerhalb des gültigen Messbereichs zu bleiben. Eine große Schichtdicke bietet Empfindlichkeit für verdünnte, überwiegend monomere Lösungen. Eine kleine Schichtdicke hält eine konzentrierte Probe im Messbereich, ohne einen starken Verdünnungsschritt, der das Gleichgewicht neu einstellen würde. Die Aggregationsstudie, aus der die oben genannten Zahlen stammen, ging genau so vor: Küvetten mit 1 Zentimeter Schichtdicke für 1.1 bis 34 mikromolar Farbstoff und Küvetten mit 0.01 Zentimeter Schichtdicke für 94 mikromolar bis 3.4 millimolar. Mikrovolumen-Messplattformen und Mikrotiterplatten-Lesegeräte bringen zusätzliche geometrische Besonderheiten mit sich: kurze und teilweise variable Lichtwege sowie Oberflächen, an denen der kationische Farbstoff adsorbieren kann. Geben Sie die Schichtdicke zusammen mit dem Messwert an, ebenso wie die Spektralreferenz Lösungsmittel und Salzgehalt angibt. Eine Absorbanz ohne Schichtdicke ist kein Ergebnis. Sie ist ein Gerücht.

Aus dem Mechanismus ergeben sich die Anforderungen an eine sorgfältige Messung. Gleichen Sie die Proben vor der Messung an dieselbe Temperatur an. Verwenden Sie denselben Küvettentyp und dieselbe Ausrichtung, passende Blindproben mit demselben Salz- und Pufferhintergrund sowie saubere Laborgefäße. Methylenblau adsorbiert an Glas und Kunststoff, und eine verfärbte Küvette trägt Rückstände der zuletzt gemessenen konzentrierten Probe. Messen Sie zeitnah nach der Herstellung, wenn die Aggregationskinetik eine Rolle spielt, und erstellen Sie jede Kalibrierkurve in derselben Matrix und bei derselben Schichtdicke wie die unbekannten Proben. Denken Sie bei visuellen Prüfungen daran, dass das Auge ein schlechter Spektrometer ist. Ob sich die Reinheit anhand der Lösungsfarbe feststellen lässt, ist eine eigene Frage, deren Antwort nein lautet. Farbtonverschiebungen durch Aggregation sind ein Grund dafür.

Ein Diagramm als Referenz neben dem Messgerät

Die folgende Abbildung fasst den Artikel zu einer Referenz für den Laborplatz zusammen. Drei Lösungen enthalten denselben Farbstoff, unterscheiden sich aber in der Gesamtkonzentration und im Salzgehalt. Ihre schematischen Spektren zeigen, wie die langwellige Monomerbande mit zunehmender Stapelbildung gegenüber der kurzwelligen Dimerbande an Anteil verliert. Die Bedingungen sind in der Abbildung angegeben, weil die Kurven ohne sie nicht weiterverwendet werden können. Gemessene Bandenpositionen unter angegebenen Bedingungen finden Sie in der Spektralreferenz. Wie der gelöste Farbstoff in Zellen gelangt, erläutert der Zelleintritt durch Reduktion und Verteilung. Wie Lichtdosis und Geometrie photochemische Messergebnisse zusätzlich beeinflussen, beschreibt Lichtexposition und Messgeometrie.

Die zentrale Regel besteht aus zwei Teilen. Das Spektrum beschreibt das Gemisch, das unter den angegebenen Bedingungen in der Küvette vorliegt. Nur eine unter denselben Bedingungen erstellte Kalibrierung wandelt eine Absorbanz in eine Gesamtkonzentration um.