Alternativen zu Methylenblau für die Mikroskopie

Für einen einfachen Bakterienausstrich kann Kristallviolett Methylenblau ersetzen, wenn das Ziel darin besteht, die Zellform zu erkennen. Bei lebenden Zellen kann Phasenkontrast ganz ohne Färbung die bessere Alternative sein. Die Wahl hängt davon ab, welche Beobachtung Sie machen müssen.

Angenommen, zwei Personen untersuchen dieselbe Bakterienkultur. Eine möchte Stäbchen von runden Zellen unterscheiden. Die andere möchte wissen, ob eine Behandlung die Bakterien abgetötet hat. Eine Färbung, die der ersten Person ein klares Bild liefert, kann der zweiten Person keine brauchbare Antwort geben.

Bevor Sie einen Ersatz wählen, vervollständigen Sie diesen Satz: „Ich muss ___ in ___ beobachten, und die Zellen müssen / müssen nicht am Leben bleiben.“ Dieser Satz definiert die Aufgabe, die die Färbung erfüllen muss.

Beginnen Sie mit dem Präparat und der Fragestellung

Entscheiden Sie zunächst, ob die Zellen am Leben bleiben müssen, und bestimmen Sie dann das Merkmal, das Sie beobachten möchten:

Die Zellen müssen am Leben bleiben: Für Bewegung oder Form kommen ungefärbter Phasenkontrast oder DIC infrage; für Kern-DNA Hoechst 33342 mit Fluoreszenz; für Membranintegrität ein validierter Assay wie SYTO 9 mit Propidiumiodid.
Die Zellen müssen nicht am Leben bleiben: Für die Bakterienmorphologie kommen eine einfache Kristallviolettfärbung oder eine Nigrosin-Negativfärbung infrage; für die Gramreaktion verwenden Sie das vollständige Gram-Färbeverfahren; für Kern-DNA in fixierten Zellen kommt DAPI-Fluoreszenz infrage.

Vergleichen Sie anhand dieser Tabelle die Einschränkungen der einzelnen Optionen. Es handelt sich um Methodenentscheidungen, nicht um Anweisungen, innerhalb eines bestehenden Protokolls einzelne Reagenzien auszutauschen.

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| Form und Anordnung von Bakterien | Präparierter Bakterienausstrich; Hellfeld | Einfache Kristallviolettfärbung | Zeigt die Morphologie; erlaubt keine Aussage über Gramreaktion oder Lebensfähigkeit. |

| Zellkonturen vor dunklem Hintergrund | Bakteriologisches Präparat; Hellfeld | Nigrosin-Negativfärbung | Präparation und Formulierung sind relevant; eine ungefärbte Zelle ist nicht zwangsläufig lebendig. |

| Bewegung oder Veränderungen in lebenden Zellen | Kompatibles Nasspräparat; Phasenkontrast oder DIC | Keine Färbung | Erfordert geeignete Optik; Kontrast identifiziert kein Molekül. |

Bei einem einfachen Ausstrich die Methode mit Bedacht ersetzen

Kristallviolett ist eine praktische Option, wenn eine einfarbige Darstellung der Bakterienmorphologie benötigt wird. Das Bacteriological Analytical Manual der FDA führt zwei Kristallviolett-Formulierungen auf, die für einfache Färbungen geeignet sind. Verwenden Sie eine dokumentierte Formulierung und die dazugehörige Zubereitungsmethode; der Name des Farbstoffs allein definiert noch kein gebrauchsfertiges Reagenz.

Kristallviolett wird auch bei der Gram-Färbung eingesetzt, doch eine einfache Kristallviolettfärbung ist deshalb noch keine Gram-Färbung. Im Gram-Färbeprotokoll der ASM hängt das differenzierende Ergebnis davon ab, dass Kristallviolett, Iod, Entfärbung und Gegenfärbung nacheinander wirken. Werden diese Schritte ausgelassen, ändert sich, welche Aussage das Bild ermöglicht. Siehe einfache Färbung im Vergleich zur Gram-Färbung für diese Unterscheidung.

Nigrosin bietet eine andere Möglichkeit, Konturen sichtbar zu machen: Es färbt den Hintergrund dunkel, während die Bakterienzellen vergleichsweise hell bleiben. In den Nigrosin-Anweisungen von Merck findet sich ein wichtiges Detail, das in einer allgemeinen Liste von Ersatzstoffen leicht übersehen werden kann. Die dort angegebene Gebrauchslösung enthält Formaldehyd. Aus der Bezeichnung „Negativfärbung“ lässt sich daher nicht ableiten, dass die Methode mit lebenden Zellen kompatibel ist, auch wenn die Zellen selbst ungefärbt erscheinen. Prüfen Sie die vollständige Formulierung und die Präparation des Untersuchungsmaterials.

Bei lebenden Präparaten einen Wechsel der Optik erwägen

Wenn Sie beobachten möchten, wie sich Zellen bewegen oder teilen, kann ein weiterer Farbstoff die Beobachtung erschweren. Wie Nikon in seinem Leitfaden zum Kontrast bei transparenten Präparaten erläutert, machen Phasenkontrast und differentieller Interferenzkontrast, kurz DIC, Präparate anhand von Unterschieden in ihren optischen Eigenschaften sichtbar. Damit können lebende, ungefärbte Zellen dargestellt werden, sofern das Mikroskop über die erforderlichen Komponenten verfügt.

Bei dieser Wahl bleibt das Präparat ungefärbt, doch die verfügbare Information verändert sich. Sie können eine Zellgrenze oder Bewegung verfolgen, ohne zu wissen, welches Molekül den Kontrast erzeugt hat. Wenn die molekulare Lokalisation die Fragestellung ist, wählen Sie stattdessen ein geeignetes Markierungsverfahren.

Für Kern-DNA unterscheidet der Vergleich von DAPI- und Hoechst-Färbungen von Invitrogen zwischen der üblichen Verwendung von DAPI bei fixierten Zellen und dem stärker zellgängigen Hoechst 33342, das für die Markierung lebender Zellen bevorzugt wird. Beide erfordern Fluoreszenzausrüstung. Keines von beiden ist ein direkter Ersatz für eine farbige Hellfeldfärbung.

Behandeln Sie Farbstoffexposition und Beleuchtung als experimentelle Bedingungen. Vergleichen Sie gefärbte und ungefärbte Präparate, wenn das Verhalten der Zellen Ihre Messgröße ist.

Eine rote Zelle ist nicht automatisch eine tote Zelle

SYTO 9 und Propidiumiodid werden häufig kombiniert, um die bakterielle Membranintegrität zu beurteilen. Das BacLight-Handbuch ordnet intakte Membranen einer grünen Färbung und geschädigte Membranen einer roten Färbung zu. Diese Interpretation muss für das jeweilige Präparat validiert werden.

Eine Studie von Rosenberg und Kollegen aus dem Jahr 2019 veranschaulicht das Problem. In 24-hour E. coli-Biofilmen auf Glas in phosphatgepufferter Kochsalzlösung erschienen in situ etwa 96% der Zellen Propidiumiodid-positiv. Dennoch schätzten die Autoren, dass nach der Gewinnung 82% kultivierbar waren. Konfokale Aufnahmen zeigten Zellen mit grünem Zellinneren unter rot gefärbtem Material, was auf extrazelluläre Nukleinsäuren als Ursache des irreführenden Signals hindeutete.

Diese Prozentwerte beschreiben unterschiedliche Messungen an den Präparaten der Studie und sind kein universeller Korrekturfaktor. Entscheidend ist zu prüfen, wodurch das Signal entstanden ist. In einem Biofilm kann ein Nukleinsäurefarbstoff sowohl Material außerhalb der Zellen als auch Material innerhalb geschädigter Zellen erfassen. Für eine Aussage zur Lebensfähigkeit empfehlen die Forschenden ergänzende Messungen, etwa Kultivierung oder metabolische Aktivität, weisen jedoch darauf hin, dass jede dieser Methoden Einschränkungen hat.

Prüfen Sie, was die Alternative tatsächlich enthält

Eine alternative Färbemethode kann weiterhin Methylenblau enthalten. Giemsa ist ein Beispiel: Merck beschreibt sein Produkt als Azure-Eosin-Methylenblau-Lösung, die unter anderem für Blut- und Knochenmarkausstriche vorgesehen ist. Für ein anderes Präparat kann dies eine andere Methode darstellen, erfüllt aber nicht die Anforderung, Methylenblau auszuschließen.

Wenn der Ausschluss einer Verbindung Teil des Experiments ist, prüfen Sie Identität und Formulierung des Reagenzes, bevor Sie Bilder vergleichen. Der Leitfaden zu Methylblau, Methylenblau und ähnlich benannten Farbstoffen erläutert die Unterschiede in der Benennung.

Überprüfen Sie die Substitution, bevor Sie das Ergebnis verwenden

Führen Sie bei einer neuen Methode einen kleinen Vergleich mit repräsentativen Präparaten und einer geeigneten Kontrolle durch. Halten Sie die Mikroskopeinstellungen nach Möglichkeit vergleichbar. Dokumentieren Sie Reagenzformulierung, Präparatherstellung, Exposition und Bildgebungsbedingungen, damit ein besser aussehendes Bild untersucht werden kann, statt lediglich bevorzugt zu werden.

Bewerten Sie den Erfolg anhand der ursprünglichen Fragestellung. Prüfen Sie bei der Morphologie, ob Zellgrenzen und Anordnung weiterhin interpretierbar sind. Prüfen Sie bei der Kernmarkierung Signalposition und Hintergrund. Verlangen Sie bei der Lebensfähigkeit mehr Evidenz als lediglich eine ansprechende Farbtrennung. Der umfassendere Leitfaden zu Methylenblau-Färbung und Laboranwendungen erläutert, wie Beobachtung und Präparation zusammenwirken.

Wählen Sie die Alternative, die die benötigte Messung erhält. Farbe ist nur eine Eigenschaft des resultierenden Bildes.