Methylenblåt og leukomethylenblåt: ét redoxpar, to farver

En studerende tilsætter et par dråber blåt farvestof til en kolbe, svinger den rundt og ser farven forsvinde. Hun ryster kolben, og den blå farve vender tilbage. Intet blev tilsat eller fjernet mellem de to tilstande ud over elektroner og kontakt med luft. Kolben rummer hele denne artikels emne: methylenblåt og dets reducerede partner, leukomethylenblåt, der omdannes til hinanden i et reversibelt redoxpar, hvor farven er aflæsningen.

Den praktiske pointe kommer først. Farveskiftet er ikke en bivirkning her. Det er det analytiske signal. Alle, der formulerer med methylenblåt, titrerer med det eller bruger det i undervisningen, bør kunne skrive halvreaktionen udenad, angive de betingelser, der forskyder den mod venstre eller højre, og nævne de urenheder, der gør resultatet uklart.

Parret i én ligning

Oxideret methylenblåt er methylthioniniumkationen: et plant phenothiaziniumsystem med svovl og nitrogen i den centrale ring og en dimethylaminogruppe i hver ende, leveret som chloridsaltet. PubChem registrerer det som methylthioniniumchlorid, C.I. Basic Blue 9. I vand absorberer monomeren omkring 664 nm, hvilket giver den blå farve, øjet ser.

Reduceret leukomethylenblåt (LMB) har det samme skelet, men nitrogenatomet i den centrale ring er protoneret, og kromoforen er brudt. Det er uladet ved næsten neutral pH og næsten farveløst, med ubetydelig absorbans i det synlige område og et kraftigt ultraviolet bånd omkring 258 nm (PubChem-opslag for leukomethylenblåt, CAS 613-11-6). Antallet af protoner i halvreaktionen afhænger af pH, fordi den reducerede form protoneres i syre (omtrentlige pKa-værdier omkring 4.5 og 5.8). Tre områder dækker det praktisk relevante interval:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, blå <=> farveløs (næsten neutral pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), blå <=> farveløs (moderat surt, 2 protoner)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> dobbelt protoneret leukoform (stærkt surt, 3 protoner)

Alle tre skrivemåder beskriver det samme par i forskellige protoneringstilstande, et forhold, som litteraturen om thiazinfarvestoffers redoxadfærd behandler systematisk. pH-afhængigheden følger Nernst-ligningen for Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, hvilket giver en hældning på omkring 29.6, 59.2 eller 88.7 mV pr. pH-enhed for m = 1, 2 eller 3. Målte hældninger omkring 28, 58 og 87 mV pr. pH-enhed bekræfter denne tilordning, så et angivet potentiale uden tilhørende pH er meningsløst.

Hvad ligningen fortæller den, der formulerer

Tre forhold følger af støkiometrien. For det første betyder to elektroner pr. molekyle, at methylenblåt i sin nettoreaktion er en to-elektronindikator og -mediator, ikke en én-elektrontransportør. For det andet deltager protoner, så det formelle potentiale ændrer sig med pH som beskrevet ovenfor. For det tredje ligger det formelle potentiale ved pH 7 omkring +0.011 V i forhold til standardbrintelektroden (omkring +0.53 V ved pH 0), hvilket placerer parret blandt milde oxidationsmidler: stærkt nok til at modtage elektroner fra gode donorer som NAD(P)H eller ascorbat, men svagt nok til at afgive dem til opløst ilt eller jern(III)-centre. Denne mellemposition er netop grunden til, at farvestoffet gennemløber en cyklus i stedet for at blive fastholdt i den ene tilstand.

Koncentrationen tilføjer endnu en nuance. Over omtrent hundrede mikromolar i vand, i overensstemmelse med en rapporteret dissociationskonstant for monomer-dimer-ligevægten omkring 170 til 250 uM ved pH 7, stables den oxiderede kation i dimerer og større aggregater med et forskudt absorptionsbånd omkring 610 til 615 nm. Et spektrum med en tilsyneladende forkert top kan derfor skyldes aggregering, ikke urenheder. Fortynd først, og vurder derefter.

Betingelser, der driver hver retning

Tabellen nedenfor er en reference til laboratoriearbejdet. Reduktion kræver en elektrondonor; genoxidation kræver en elektronacceptor, og luft er som regel tilstrækkeligt.

Alle rækker følger den samme ligning. Kun drivkraften ændrer sig. Det er i den forstand, at parret er reversibelt: Reaktionsvejen er den samme, men gennemløbes i modsatte retninger under modsatte betingelser.

Den blå flaske forklaret

Demonstrationens mekanisme fortjener en klar forklaring, fordi den viser parret i miniature. I en basisk glukoseopløsning fremmer basen enolisering af glukose, og det dannede enediolat reducerer methylenblåt til leukomethylenblåt, så kolben bliver farveløs. Omrystning opløser ilt fra luftrummet over væsken, ilten genoxiderer leukoformen, og den blå farve vender tilbage. Når kolben står stille, opbruges den opløste ilt nær reaktionszonen ved overfladen, og glukosen får igen overtaget. Cyklussen gentages, indtil glukosen er opbrugt, og hver omrystning er en synlig Nernst-ligning: Øg oxidationsmidlets aktivitet, og ligevægten forskydes mod blå.

Radikalet i midten

Nettoreaktionen overfører to elektroner, men elementartrinnene overfører én ad gangen. Mellem den blå kation og den farveløse leukoform findes et semiquinonradikal som mellemprodukt, der hovedsageligt disproportionerer tilbage til parrets to former i stedet for at ophobes. Dets én-elektronpotentiale omkring minus 0.23 V ved pH 7 ligger langt under nettoreaktionens to-elektronmidtpunkt, hvilket er grunden til, at radikalet kun findes i en lille mængde i stationær tilstand. Det har betydning af to grunde. Ved belysning når farvestoffet exciterede tilstande, som åbner radikalreaktionsveje. Derfor er methylenblåtopløsninger lysfølsomme, og derfor hører fotokemi hjemme i enhver stabilitetsprotokol. Og ved høj koncentration dimeriserer den oxiderede form, hvilket ændrer spektret og den tilsyneladende kinetik uden at ændre det underliggende par. Ingen af forholdene ophæver reversibiliteten. Begge forklarer observationer, der ellers ligner irreversibilitet.

Demethylerede slægtninge forskyder skalaen

Fjern methylgrupper fra de to dimethylaminoarme, og parret består med ændrede egenskaber. Absorptionsmaksimum forskydes monotont mod kortere bølgelængder ved hver demethylering: methylenblåt omkring 664 nm, Azure B omkring 654, Azure A omkring 630, Azure C omkring 615 og thionin omkring 600 nm. Azure B, som mangler én methylgruppe, er den nærmeste slægtning: en væsentlig metabolit af methylenblåt og en dokumenteret urenhed i methylenblåtmateriale. Azure A og Azure C fortsætter serien med det samme redoxaktive skelet. Thionin, hvor begge aminogrupper er fuldstændigt demethylerede, ligger i enden med et formelt potentiale omkring +0.06 V ved pH 7 sammenlignet med methylenblåt ved +0.011 V og er mærkbart lettere at reducere. Redoxpotentialerne i serien afhænger af medium og elektrode, så sammenlign kun værdier under samme betingelser. Derfor handler urenhedsprofilering også om redox, ikke blot om at sætte flueben ved renhed. Nogle få procent Azure B betyder nogle få procent af et andet redoxpar i flasken, og Azure B som urenhed og metabolit dokumenterer, hvordan denne andel kontrolleres.

Hvor biologien kommer ind

Inde i et rødt blodlegeme reducerer NADPH methylenblåt til leukomethylenblåt, og leukoformen overfører elektroner til hæmjern i jern(III)-tilstanden, så hæmoglobinets jern(II)-tilstand genoprettes. Denne ene elektronoverførsel er det kemiske grundlag for brugen af methylenblåt ved erhvervet methæmoglobinæmi. Alt, der følger efter denne overførsel — energiomsætning, mitokondriel elektronstrøm og ethvert biologisk resultat — hører under mitokondriel elektrontransport og behandles bevidst kun dér.

Køb parret, ikke kun farven

Et redoxfarvestof er kun så godt som sin specifikation. Høj renhed er vigtig, fordi methylenblåt, der ikke opfylder USP, typisk er af tekstilkvalitet og indeholder Azure B, tungmetaller eller restopløsningsmidler, som forskyder redoxaflæsninger og gør endepunkter uklare — forhold, som ingen farvningsprotokol screener for. De fleste sælgere, der hævder overensstemmelse med USP, tester kun for tungmetaller og erklærer sig derefter i mål. Fuld overensstemmelse omfatter identitet, indholdsbestemmelse, organiske urenheder, restopløsningsmidler, elementære urenheder, gløderest, mikrobielle grænseværdier og bakterielle endotoksiner, og sådan vælger du methylenblåt af farmaceutisk kvalitet gennemgår, hvordan dokumentationen læses. Blupreme samarbejder med en farmaceutisk producent af methylenblåt, tester hele USP-specifikationen og offentliggør det fuldstændige analysecertifikat (COA). Når farven er målingen, er den dokumentation en del af instrumentet.