Farvning med methylenblåt: mikroskopimetoder og et atlas med virkelige billeder

Farvning med methylenblåt gør ellers svagt synlige cellestrukturer lettere at skelne i lysfeltmikroskopi. Det kan hjælpe elever med at finde kernen i en kindcelle eller undersøge mikroorganismers konturer og indbyrdes placering. En blå genstand er dog en observation. At navngive organismen, måle den og afgøre, om den tyder på sygdom, er særskilte opgaver.

Forsidebilledet illustrerer kontrastprincippet. Atlasset nedenfor indeholder virkelige fotografier af uafhængigt dokumenterede prøver med deres oprindelige kildeoplysninger.

Hvad synliggør methylenblåt?

Methylenblåt er et basisk farvestof: dets farvede ion har en positiv ladning. Som OpenStax forklarer i sin gennemgang af prøvefarvning, vekselvirker basiske farvestoffer med negativt ladet cellemateriale og kan få celler til at træde frem mod en lysere baggrund. I egnede præparater fremhæver methylenblåt områder med et højt indhold af nukleinsyrer og andre strukturer, der binder farvestoffet.

Ved simpel farvning skaber ét farvestof kontrast. Flere organismer kan derfor se blå ud uden at være den samme organisme. De nyttige spørgsmål er i første omgang beskrivende: Er objekterne runde eller aflange, enkeltstående eller samlet i klynger, ensartet farvede eller med synlige indre forskelle? Se forskellen mellem simpel farvning og Gramfarvning, før du fortolker farve som et klassifikationsresultat.

Kontrast og opløsning er forskellige ting. Kontrast hjælper med at skelne et objekt fra dets omgivelser; opløsning adskiller detaljer, der ligger tæt på hinanden. Et mørkere billede garanterer ikke, at flere strukturer kan skelnes. Og ikke hvert mørkt granulat bør betegnes som en organel.

Native præparater, farvede vådpræparater og udstrygninger

Et ufarvet, eller nativt, vådpræparat giver et indblik uden tilsat farvestof, selv om fjernelsen fra det oprindelige miljø stadig ændrer prøven. I et farvet vådpræparat tilsættes reagens, mens materialet forbliver i væske under et dækglas. I en fikseret udstrygning fordeles materialet på et objektglas og fikseres med en bestemt metode før den efterfølgende behandling. OpenStax' oversigt over præparation skelner mellem vådpræparater og fiksering og forklarer, hvorfor fikserede organismer ikke længere giver indblik i normal bevægelse eller normalt stofskifte.

Disse præparater besvarer forskellige spørgsmål:

Ved en sammenligning i undervisningen skal du dokumentere et ufarvet præparat, før du undersøger et separat farvet præparat fremstillet efter undervisningsprotokollen. Sørg for sammenlignelig belysning og sammenlignelige indstillinger for billedoptagelse. Hvis to forskellige celler fotograferes, skal du beskrive dem som eksempler, ikke som en før-og-efter-dokumentation af én celle.

Mikroskopiatlas: tre virkelige farvede prøver

Dette atlas er et selvstændigt udvalg og en fortolkning af tre mikrofotografier med åbne licenser. Ophavspersonerne angiver prøverne og farvestofferne. Vi har ikke uafhængigt verificeret deres prøver. Billederne gengives ubeskåret som tabsfri WebP-konverteringer, uden tilføjede elementer eller farveændringer.

Tavle 1: menneskelige kindceller

Prøve: menneskelige kindceller. Farvestof: methylenblåt. Forstørrelse: 400×, oplyst af fotografen. Målestokslinje: ikke tilgængelig; kilden angiver ingen kalibreret pixelstørrelse. Fotografi af Fritzmann2002, 2017, fra Menneskelige kindceller (farvning med methylenblåt), licenseret under CC BY-SA 4.0. Denne gengivelse bevarer den licens.

Start med en enkeltstående celle: dens mørkere kerne er lettere at skelne fra det omgivende blå cytoplasma. Undersøg derefter de overlappende celler nedenunder. Overlap gør en grænse sværere at følge og kan skabe et lokalt mørkere område. Brug denne tavle til at øve dig i at følge konturer, ikke til at tælle hver mørk plet som en kerne. Guiden til observation af kindceller uddyber øvelsen for denne prøvetype.

Tavle 2: løgceller

Prøve: løgceller, som angivet af kilden. Farvestof: methylenblåt. Forstørrelse: “200x” indgår i det oprindelige filnavn; den er ikke uafhængigt valideret. Målestokslinje: ikke tilgængelig; ingen kalibrering er angivet. Fotografi af Alvy16, 2019, fra Løgcelle 200x, licenseret under CC BY 4.0.

De aflange rum danner et ordnet lag. Sammenlign deres lange fælles grænser med de uregelmæssige konturer i Tavle 1. Bemærk også det iøjnefaldende mørke materiale og den ujævne lysstyrke i synsfeltet. Fotografiet fastslår ikke identiteten af hver mørk aflejring. Det viser, hvorfor en nyttig observationsbeskrivelse omfatter artefakter og usikkerhed frem for at sætte betegnelser på alt, der optager farve.

Tavle 3: gær angivet af kilden som Candida spp.

Prøve: Candida spp., ifølge fotografen. Farvestof: simpel positiv farvning med methylenblåt. Forstørrelse: ikke tilgængelig. Målestokslinje: ikke tilgængelig; ingen kalibreret pixelstørrelse er angivet. Fotografi af Marta, Wikimedia-brugeren Martunia.g, 2021, fra Positiv farvning med methylenblåt 2, licenseret under CC BY 4.0.

Sammenlign de tætte blå klynger med de mindre tætpakkede randområder. De enkelte konturer er lettere at følge, hvor objekterne overlapper mindre. Navnet Candida stammer fra kildeoplysningerne, ikke fra en artsidentifikation udført på dette fotografi. Denne tavle giver heller ikke noget resultat om levedygtighed. Analyser af gærs levedygtighed og respiration kræver deres egne betingelser, kontroller og fortolkning.

Aflæsning af målestok korrekt

Disse tavler understøtter visuel sammenligning, ikke målinger i mikrometer eller sammenligninger af absolut cellestørrelse mellem tavlerne. Oplyst forstørrelse kan ikke erstatte manglende kamerakalibrering. Ændring af et billedes visningsstørrelse ændrer dets tilsyneladende forstørrelse.

For dine egne billeder skal du fastlægge en målekalibrering med en kendt standard og den relevante optiske opstilling. Nikons guide til mikrometri forklarer, hvordan et objektmikrometer omregner vilkårlige billed- eller trådkorsinddelinger til fysiske længder. Registrer objektivet, kamerakonfigurationen og kalibreringen, og tilføj en målestokslinje ud fra disse data. Udled ikke en målestokslinje ud fra en lærebogs gennemsnitlige cellestørrelse.

Passer flasken til metoden?

En flaske mærket methylenblåt er ikke en fuldstændig laboratoriespecifikation. Kontroller dens koncentration og enheder, opløsningsmiddel, øvrige ingredienser, tilsigtede anvendelse, batchdokumentation og anvisninger. Et reagens' sikkerhedsdatablad beskriver farerne; metodeanvisningerne fastlægger, hvordan det skal bruges til det tilsigtede præparat.

Et konkret eksempel er Mercks Löfflers methylenblåtopløsning. Producenten angiver den som et mikroskopireagens og beskriver dens rolle som kontrastfarve ved syrefast farvning. Den angivne brandfarlighed viser også, hvorfor “en blå væske” er utilstrækkelig information til at planlægge håndtering eller opvarmning. Disse egenskaber gælder for den formulering, ikke automatisk for enhver vandig methylenblåtopløsning.

Tilsvarende er eosin-methylenblåt-agar et formuleret dyrkningsmedium. Det er ikke en objektglasfarvning, der fremstilles ved at tilsætte rent methylenblåt til en prøve. Hvis formålet med billeddannelsen er et andet, kan du sammenligne alternativer til methylenblåt til mikroskopi.

Ved et mikroskopsæt til begyndere skal du starte med dets dokumenterede undervisningsmetode, kendte færdigpræparater og det specificerede reagens. Hvis en flaske har mistet sin etiket, eller dens sammensætning ikke kan fastslås, skal du erstatte den med det passende dokumenterede reagens. Brug øjenbeskyttelse, og følg de håndteringsanvisninger, der følger med den konkrete formulering. Menneskeligt materiale og ukendte miljøprøver kræver undervisningslaboratoriets procedurer for prøvehåndtering og bortskaffelse; farvning erstatter ikke disse procedurer.

Skriv observationen før konklusionen

“Blå ovale objekter i klynger” er en fagligt forsvarlig beskrivelse af et billede. “En bestemt infektion” kræver evidens, som billedet ikke har leveret. Hold prøvens oprindelse, præparation, farvereaktion og identifikationsmetode adskilt i notesbogen. Denne skelnen gør et enkelt undervisningsbillede nyttigt og forhindrer et flot mikrofotografi i at blive tillagt en påstand, det ikke kan understøtte.