Sådan kommer methylenblåt ind i celler: reduktion, reoxidation og optag

Hvis man ser en skål med endotelceller optage methylenblåt, er den oplagte fortolkning også den forkerte. Mediet mister sin blå farve, og cellerne får blå granula, så farvestoffet må være passeret gennem membranen som det blå molekyle. Forsøgene viser noget andet. Den blå form passerer næsten ikke. Det er den farveløse form, der passerer, og den blå farve, man ser inde i cellen, dannes derinde efter ankomsten.

Denne omvendte rækkefølge er vigtig, fordi den afgør, hvad farvningen kan og ikke kan fortælle. Blå granula viser oxideret farvestof, som er blevet reoxideret og fastholdt i organeller. De viser ikke cellens samlede mængde farvestof, de viser ikke den reducerede pulje, og de måler ikke biologisk effekt. For at forstå hvorfor skal man følge de tre trin: reduktion ved overfladen, diffusion af den reducerede form samt reoxidation og fastholdelse inde i cellen.

De to former opfører sig som forskellige molekyler

Oxideret methylenblåt er et fladt, positivt ladet ringsystem. Det opløses i vand, absorberer lys kraftigt ved omkring 600 til 700 nanometers bølgelængde og ser blåt ud. Ladningen er det afgørende. Et ladet, vandelskende molekyle glider ikke let gennem en lipidmembran, så den præcise formulering i litteraturen er relativt membranimpermeabelt, ikke impermeabelt.

Reduceret methylenblåt, kaldet leucomethylenblåt, er farveløst, uladet og fedtopløseligt. Fjern ladningen, og membranen holder op med at være en mur. Det reducerede molekyle diffunderer let igennem, og når det er inde i et mere oxiderende rum, kan det igen afgive elektroner og vende tilbage til den blå, ladede og fastholdte form. Farvestoffets redoxkemi er derfor også dets transportmekanisme. Ændrer man antallet af elektroner, ændrer man permeabiliteten.

Elektronerne til det første trin kommer fra cellen selv. Pattedyrceller transporterer elektroner gennem plasmamembranen og flytter reducerende ækvivalenter fra intracellulære donorer ud til acceptorer ved overfladen. Denne aktivitet på tværs af plasmamembranen er en normal cellefunktion, som findes i de fleste celletyper. Den reduktase på endoteloverfladen, der håndterer thiazinfarvestoffer, opfører sig som andre reduktaser på ét afgørende punkt: Den fortsætter med at arbejde i nærvær af cyanid og azid ved doser, der standser de senere trin. Denne adskillelse er omdrejningspunktet for hele forklaringen.

Fordeling kom først og forklarede næsten optaget

I 1929 stillede Marian Irwin ved Rockefeller Institute et enklere spørgsmål. Måske skyldes farvestoffets indtrængning blot en fordeling mellem vand og cellens fedtholdige lag, og måske kan et chloroformlag fungere som erstatning for disse fedtholdige lag i laboratoriet. I sine spektrofotometriske undersøgelser af indtrængning rystede hun vandige farvestofopløsninger med chloroform og sammenlignede det, der bevægede sig over i den organiske fase, med det, der trængte ind i levende algeceller.

To resultater fra dette arbejde fortjener stadig opmærksomhed. For det første indeholdt kommercielle methylenblåtopløsninger trimethylthionin, som nu kaldes azure B. Denne urenhed trængte hurtigere ind end selve methylenblåt, især ved alkalisk pH, hvor den lipidopløselige, frie baseform dominerer. Noget af det tilsyneladende optag af methylenblåt var i virkeligheden selektivt optag af azure B. For det andet bestemte pH udfaldet ved at bestemme ioniseringstilstanden, og beskadigede celler lod langt mere farvestof komme ind end intakte celler. Fordelingskoefficienter og ladningstilstand styrede, hvad henholdsvis det kunstige system og den levende celle optog, og ligheden mellem de to understøttede idéen om ikke-vandige lag ved cellegrænsen.

Modellen var fremsynet med hensyn til lipider og ionisering, men den kunne ikke skelne mellem et farvestof, der fordeler sig i sin oprindelige form, og et farvestof, der omdannes kemisk ved overfladen, passerer i forklædning og omdannes tilbage inde i cellen. Denne skelnen krævede et andet forsøg, som kom halvfjerds år senere i lungeendotel.

Reduktion udenfor, fastholdelse indenfor

Merker og kolleger arbejdede med dyrkede endotelceller fra kvægs lungearterier og foreslog et forløb i tre trin: Det oxiderede farvestof reduceres på celleoverfladen til sin farveløse, lipofile form, den reducerede form diffunderer ind, og intracellulær reoxidation gendanner den membranimpermeable, oxiderede form, som ophobes. Deres undersøgelse af endotelcellers optag af thiaziner testede derefter forløbet ved at forsøge at afbryde det på bestemte steder.

Det første redskab var ferricyanid, en elektronacceptor, som ikke kan trænge ind i cellen. Når overfladeenzymer reducerer blåt farvestof til dets farveløse form uden for cellen, kan ferricyanid tage elektronerne tilbage og gendanne blåt farvestof i mediet, før det overhovedet passerer membranen. Så længe ferricyanid var til stede i overskud (10 micromolar farvestof over for 50 til 500 micromolar ferricyanid), standsede farvestofoptaget næsten helt. Først når ferricyanidet var opbrugt, genoptoges optaget med normal hastighed. Kinetikken fortalte den samme historie på en anden måde. Ferricyanid forsvandt med en omtrent konstant hastighed, hvilket stemte med en jævn strøm af reduktion ved overfladen, der forsynede en genanvendelig mediator, mens det ekstracellulære farvestof forsvandt eksponentielt, efterhånden som puljen blev tømt. En konstant strøm sammen med en pulje, der tømmes, betyder, at ferricyanidsignalet afspejler vedvarende reduktion, ikke farvestofmolekyler, der forlader opløsningen.

Det andet redskab fjernede selve passagen gennem membranen. Gruppen koblede toluidinblåt O, et nært beslægtet thiazinfarvestof, til en stor polyakrylamidkæde, der var for stor til at trænge ind i cellen i nogen af oxidationstilstandene. Cellerne reducerede stadig det bundne farvestof. Reduktion kræver derfor ikke adgang til cellens indre. Maskineriet er eksponeret ved overfladen eller elektrisk koblet til den.

Derefter kom den adskillelse, som giver artiklen dens titel. Cyanid og azid ved 2 millimolar hæmmede farvestofophobningen kraftigt, og under mikroskopet var de mørkeblå og lilla inklusioner, som normalt omgiver cellekernen, næsten forsvundet. Alligevel bremsede ingen af hæmmerne den ekstracellulære reduktion: Ferricyanidcyklussen fortsatte uformindsket, og den ikke-permeerende polymer blev stadig reduceret. Blokeringen lå længere fremme i forløbet. Cyanid og azid standsede intracellulær reoxidation og fastholdelse, ikke reduktion ved overfladen. Kontrolforsøg med cellelevedygtighed understøttede denne fortolkning, da cellerne bevarede deres cytosoliske markørenzym laktatdehydrogenase under disse behandlinger. Tabet af optag skyldtes derfor ikke blot forgiftning eller brud på membranen.

Et forbehold fra artiklen gælder stadig. De blå inklusioner lå omkring, men ikke inde i, cellekernen, hvilket stemmer med oxidation inde i subcellulære organeller, men undersøgelsen identificerede ikke, hvilke organeller der var tale om. Lignende mønstre i andre celletyper var blevet betegnet som lysosomale på et spinkelt grundlag. Betragt fastholdelsen som påvist og placeringen som foreløbig. Læsere, der følger elektronernes videre vej, kan fortsætte til mitokondriel elektrontransport og redoxhåndtering og det bredere billede af absorption og fordeling efter administrationsvej.

Farvning er ikke eksponering

En tredje undersøgelse viser, hvad der sker, når denne optagsmekanisme møder en biologisk måling. Scott og kolleger fandt, at methyl-beta-cyclodextrin, en torusformet sukkerring, binder methylenblåt direkte med en associationskonstant på omkring 310 per molar for inklusionskomplekset mod omkring 5846 per molar for farvestoffets dimerisering. I L929-fibroblaster blokerede denne binding både cellefarvning og stimuleringen af glukoseoptag: Forinkubation med cyclodextrinet forhindrede blåfarvning, og tilsætning bagefter fremskyndede affarvningen. Efterhånden som det optiske blå signal forsvandt fra cellerne, aftog den aktiverede glukosetransport i tæt parallel.

Forfatterne fortolkede denne sammenhæng som støtte for en direkte interaktion mellem farvestoffet og et protein i den signalvej, der aktiverer glukosetransportøren, frem for en mekanisme med langvarigt oxidativt stress. Denne slutning er rimelig, men har klare grænser. Forsøget identificerer ikke proteinet, det viser ikke binding til selve transportøren, og sammenhængen mellem affarvning og tab af effekt kan ikke udelukke enhver redoxmedieret mekanisme.

Den varige lære handler om måling. Optisk farvning viser synligt, oxideret, celleassocieret farvestof. Den overser fuldstændig den farveløse, reducerede pulje, så en bleg celle kan stadig indeholde farvestofækvivalenter. En intenst farvet celle viser fastholdt, oxideret farvestof snarere end samlet vævseksponering eller effektstørrelse. Det samme forbehold gælder i større skala: At sammenligne farvning på tværs af celletyper eller behandle et mørkt vævssnit som bevis på højere eksponering gentager den oprindelige fejltolkning af skålen. Optag er en cyklus af reduktion, diffusion og reoxidation, og ethvert enkelt øjebliksbillede af den blå form viser kun ét hjørne af den. De praktiske konsekvenser for farvning og håndtering i laboratoriet og for fortolkning af udsagn om dosis og eksponering følger direkte heraf.