Rozpustnost methylenové modři ve vodě a příprava roztoku z prášku

Dva laboranti připravují každý 1procentní roztok methylenové modři z prášku. Jeden naváží 1.00 gramu a doplní baňku na 100 mL. Druhý naváží 1.00 gramu, přidá jej do 100 mL vody a považuje přípravu za hotovou. Třetí laborant naváží 1.00 gramu z jiné šarže a získá měřitelně odlišnou koncentraci. Všechny tři lahve jsou označeny stejně. Ani jedna neobsahuje přesně to, co uvádí štítek, a rozdíly pramení ze tří věcí, které se snadno zaměňují: kolik látky rozpouštědlo dokáže rozpustit, co navážený prášek skutečně představuje a k čemu se procenta vztahují.

Tento průvodce se týká pouze přípravy laboratorních roztoků: barvicích roztoků, indikátorů, analytických zásobních roztoků a pracovních ředění. Není to návod na přípravu léčiv k perorálnímu nebo injekčnímu podání a zde uvedené koncentrace nelze chápat jako dávky.

Co rozpustnost určuje a co ne

Rozpustnost methylenové modři ve vodě je na barvivo vysoká. Záznam sloučeniny methylenová modř v databázi PubChem uvádí přibližně 43.6 gramu na litr při 25 C, což odpovídá 4.36 gramu na 100 mL neboli 4.36 procenta w/v. Nezávislá studie ustavení rovnováhy při stejné teplotě naměřila 43.21 g/L a potvrdila starší hodnotu v mezích experimentální chyby.

Toto číslo je horní mez, nikoli cílová hodnota. 1procentní zásobní roztok má koncentraci 10 g/L, tedy méně než čtvrtinu této meze. 0.1procentní zásobní roztok má koncentraci 1 g/L, přibližně jednu čtyřicetinu této hodnoty. Pokud po řádném promíchání 1procentního roztoku při pokojové teplotě přetrvávají pevné částice, problém téměř nikdy nespočívá v mezní rozpustnosti. Obvykle jde o nedostatečné smáčení, studenou vodu, hrudky prášku, které potřebují více času, nebo nesprávně identifikovanou rozpuštěnou látku. Většinu těchto problémů vyřeší teplá voda a míchání. Pokud jste roztok zahřívali, před doplněním na konečný objem nechte baňku vrátit na teplotu, při níž byla kalibrována.

Rozpustnost v jiných rozpouštědlech je nižší a údaje z různých zdrojů se více liší, částečně kvůli odlišnému stupni hydratace zkoušeného materiálu. Voda zůstává referenčním rozpouštědlem pro běžné laboratorní zásobní roztoky. Ethanol barvivo rozpouští, ale pojme ho podstatně méně než voda; chloroform ho rovněž rozpouští, pyridin jen mírně a diethylether prakticky vůbec. Aceton a ethylacetát vykazují v naměřených řadách hodnoty výrazně nižší než voda. Při práci s nevodnými roztoky považujte jakýkoli údaj z příručky za výchozí odhad, který je třeba ověřit na konkrétní šarži, nikoli za mez pro přípravu roztoku. Praktický závěr je jednoduchý: pokud je cílem definovaná koncentrace ve vodném roztoku nejvýše 1 procento, voda poskytuje značnou rezervu.

Prášek nemá vždy stejné složení

Prášková methylenová modř prodávaná pro laboratorní použití je chloridová sůl, která ve své krystalové mřížce obsahuje vodu, a množství této vody se liší. Bezvodý iont má molární hmotnost 319.85 g/mol. Běžně uváděný trihydrát má 373.90 g/mol a pentahydrát 409.93 g/mol; tyto hodnoty jsou uvedeny v údajích z monografie USP shrnutých spolu se záznamem v databázi PubChem.

Komerční balení bývají označena jako trihydrát, CAS 7220-79-3, ale studie pevné fáze zjistily, že skutečný materiál může být pentahydrát, částečný hydrát s přibližně 2.2 molekulami vody, dihydrát nebo monohydrát, přičemž některé analýzy neprokázaly samostatnou krystalickou fázi trihydrátu. Barvivo je také hygroskopické, takže obsah vody v otevřeném balení se mění. Pro kvalitativní barvení to téměř nehraje roli. Pro kvantitativní analytickou práci je to však velmi důležité, a proto průvodce interpretací stanoveného obsahu a obsahu vody v certifikátu analýzy považuje dokumentaci šarže za směrodatnější než slovo trihydrát na předním štítku.

Z toho vyplývají dva způsoby korekce, přičemž použít se má vždy jen jeden. Pokud certifikát uvádí stanovený obsah a obsah vody nebo ztrátu sušením, použijte přímo tyto hodnoty. Pokud údaje z certifikátu nejsou k dispozici a koncentraci je nutné vyjádřit jako bezvodý ekvivalent, použijte teoretický faktor hydrátu: 373.90 děleno 319.85, tedy 1.169, pro nominální trihydrát a 409.93 děleno 319.85, tedy 1.282, pro nominální pentahydrát. Nepoužívejte obě korekce současně. Tím byste vodu započítali dvakrát.

Co znamenají procenta

Procenta w/v znamenají gramy uvedené rozpuštěné látky na 100 mL konečného roztoku, nikoli na 100 mL výchozí vody. 1 procento w/v tedy znamená 1.000 g na 100 mL konečného roztoku, což odpovídá 10 mg/mL nebo 10 g/L. 0.1procentní roztok obsahuje 0.100 g na 100 mL konečného roztoku, což odpovídá 1 mg/mL. Běžná záměna 1 procenta za 1 mg/mL je desetinásobná chyba a vyplatí se kvůli ní zkontrolovat každý štítek.

Druhou částí definice je specifikace rozpuštěné látky. 1procentní roztok vztažený k naváženému prášku trihydrátu a 1procentní roztok vyjádřený jako bezvodý ekvivalent jsou různé roztoky. Níže uvedené příklady pokaždé uvádějí konečný objem i základ vyjádření koncentrace. Právě tento návyk předchází výše popsanému problému tří laborantů.

Příklady přípravy s uvedenými předpoklady o hydrátu

Všechny příklady předpokládají čistý prášek uvedeného hydrátu a vodu jako rozpouštědlo při pokojové teplotě. Pro jiné objemy upravte množství přímo úměrně.

Příklad A: 100.0 mL roztoku o koncentraci 1 procento w/v, vztaženo k naváženému trihydrátu. Navažte 1.000 g trihydrátu methylenové modři. Přidejte přibližně 70 mL čištěné vody, míchejte nebo krouživě pohybujte nádobou až do úplného rozpuštění, kvantitativně převeďte do odměrné baňky o objemu 100.0 mL včetně oplachů a poté doplňte vodou po rysku. Rozpuštěnou látkou je samotný trihydrát, takže se žádná korekce podle molární hmotnosti neprovádí. Výsledek: 1.000 g na konečný objem 100.0 mL, tedy 10 mg/mL naváženého prášku.

Příklad B: 100.0 mL roztoku o koncentraci 1 mg/mL, vyjádřeno jako bezvodý ekvivalent, z nominálního trihydrátu. Cílem je 100.0 mg bezvodé methylenové modři v konečném objemu 100.0 mL. Pro korekci na tři molekuly vody vynásobte hodnotu faktorem 1.169: 100.0 mg krát 1.169 se rovná 116.9 mg. Navažte 116.9 mg nominálního trihydrátu, rozpusťte v přibližně 70 mL vody a v odměrné baňce doplňte na konečný objem 100.0 mL. U nominálního pentahydrátu je faktor 1.282, takže pro stejný cíl je potřeba 128.2 mg. Na štítek zaznamenejte, který faktor byl použit.

Příklad C: ředění methylenové modři z 1procentního zásobního roztoku na 0.1 procenta. Použijte vztah C1V1 se rovná C2V2. Pro přípravu 100.0 mL 0.1procentního roztoku z 1.0procentního zásobního roztoku je potřebný objem zásobního roztoku 0.1 krát 100.0 děleno 1.0, tedy 10.0 mL. Odpipetujte 10.0 mL 1procentního zásobního roztoku do baňky o objemu 100.0 mL a doplňte vodou po rysku. Pro analytiky, kteří dávají přednost hmotnostním jednotkám: 1 procento odpovídá 10 mg/mL, takže 10.0 mL obsahuje 100 mg a 100 mg v konečném objemu 100.0 mL odpovídá 1 mg/mL, tedy 0.1 procenta.

Příklad D: 1.000 L pracovního roztoku o koncentraci 10 mg/L ze zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/mL. Zásobní roztok o koncentraci 1 mg/mL odpovídá 1000 mg/L. Potřebný objem je 10 krát 1.000 děleno 1000, tedy 0.0100 L neboli 10.0 mL. Odpipetujte 10.0 mL zásobního roztoku a zřeďte vodou na konečný objem 1.000 L. Z 1procentního zásobního roztoku o koncentraci 10,000 mg/L stačí pro stejný cíl pouze 1.00 mL doplněný na 1.000 L. Pokud poměr ředění přesahuje přibližně sto, postupné ředění ve dvou krocích poskytuje lepší přesnost než jediný přenos mikrolitrového objemu.

Každý z těchto postupů představuje úplnou specifikaci jen proto, že obsahuje tři údaje: naváženou hmotnost s předpokladem o hydrátu, konečný objem roztoku a základ vyjádření uvedené koncentrace. Záznam v laboratorním deníku, v němž chybí byť jediný z těchto tří údajů, nelze přesně reprodukovat.

Postup, který předchází obvyklým chybám

Nejprve rozpusťte prášek v objemu menším, než je konečný objem, a teprve potom doplňte na požadovaný objem. Přidáním prášku přímo do celého konečného objemu vody vznikne roztok, jehož celkový objem překročí zamýšlenou rysku, a koncentrace bude nižší. Kádinku vypláchněte do baňky, aby v ní nezůstalo žádné barvivo; intenzivní zbarvení zviditelňuje i malé ztráty, což je výhoda, pokud vás vede ke kvantitativnímu převodu.

Před doplněním na konečný objem míchejte, dokud nezmizí všechny částice, a roztok zkontrolujte proti světlu. Filtrujte pouze tehdy, když to metoda vyžaduje. Methylenová modř se adsorbuje na některé membránové materiály, takže filtrace může snížit koncentraci právě standardizovaného zásobního roztoku. Tento jev je doložen studiemi adsorpce na membránách a je vhodné na něj pamatovat vždy, když je součástí metody filtrace nebo ověřování koncentrace. Pokud musí mít filtrovaný zásobní roztok certifikovanou koncentraci, ověřujte ji po filtraci, nikoli před ní.

Připravené roztoky skladujte při pokojové teplotě chráněné před silným světlem v hnědých nebo neprůhledných lahvích a na štítku uveďte rozpuštěnou látku, hydrátový základ koncentrace, koncentraci, rozpouštědlo, datum a osobu, která roztok připravila. Fotoblednutí při trvalém osvětlení je známým mechanismem degradace, takže okenní parapety a osvětlené chladničky jsou pro skladování nevhodné, i když barvivo vypadá stabilně. Očekávanou stabilitu a intervaly opakovaného ověřování řeší průvodce skladováním a stabilitou připravených roztoků. Jako praktické pravidlo však platí, že analytické zásobní roztoky je vhodné připravovat čerstvé nebo znovu ověřovat, místo abyste jim důvěřovali neomezeně dlouho.

S práškem a koncentrovanými zásobními roztoky pracujte v rukavicích, s ochranou očí, v laboratorním plášti a s ochranným krytím pracovní plochy; lahve umístěte do sekundárních záchytných nádob. Barvivo rychle zabarvuje kůži, oděvy, pracovní plochy a plasty a bezpečnostní listy dodavatelů klasifikují prášek podle jakosti jako zdraví škodlivý při požití a dráždivý pro oči a kůži. Úplná bezpečnostní opatření popisují zásady bezpečné manipulace a skladování, ale i samotné předcházení nežádoucímu zabarvení je opatřením k zajištění kvality: zbytky barviva na skle a pipetách jsou při stopové analýze zdrojem křížové kontaminace.

Poznámka k jakosti

Pro barvicí lázně a demonstrační pokusy postačí jakákoli čistá laboratorní jakost připravená ve správné koncentraci. Pro kvantitativní nebo srovnávací práci je jakost důležitá, protože se liší nečistoty: zbytkový Azure B a příbuzné thiaziny, těžké kovy, zbytková rozpouštědla a mikrobiální zátěž. Proto je volba jakosti doložené úplným certifikátem analýzy součástí přípravy roztoku, nikoli dodatečnou úvahou. Úplná dokumentace šarže uvádí identitu, stanovený obsah včetně základu jeho vyjádření, obsah vody a skutečně testovaný soubor nečistot, takže korekce na hydrát ve výše uvedených příkladech vychází z naměřených hodnot místo předpokladu nominálního trihydrátu. Pokud dvě šarže při stejné navážené hmotnosti poskytují různé koncentrace, certifikát obvykle vysvětluje proč.