Paul Ehrlich a methylenová modř: jak barvivo pomohlo utvářet objevování léčiv

Přínosem Paula Ehrlicha pro medicínu nebyl lék. Byl jím argument, jak na lék nahlížet.

V roce 1878 předložil doktorskou práci, jejíž úvodní oddíl nesl název „Chemické pojetí barvení“. Tvrdil v něm, že barvení tkáňového řezu a barvení kusu látky se řídí stejnou logikou. V obou případech se barvivo váže díky chemické afinitě mezi ním a materiálem, nikoli proto, že by tkáň byla nasákavá, mastná nebo tvarovaná tak, aby zachycovala pigment. Ehrlich vyrůstal při pozorování svého bratrance, patologa Karla Weigerta, jak připravuje obarvené řezy. Jeho pozornost však nepoutaly obrazy, nýbrž skutečnost, že si barvivo vybírá, kam pronikne.

Toto tvrzení zní skromně. Skromné ale není. Pokud se barvivo váže na tkáň z chemických důvodů, pak obraz jejího obarvení vypovídá o chemii této tkáně. Obarvený preparát přestává být ilustrací a stává se měřením.

Na tom ihned stavěl dál. V roce 1880 spojil methylenovou modř s kyselým fuchsinem a směs označil za neutrální barvivo, neutrální barvicí látku. Ta rozlišovala různé druhy bílých krvinek tam, kde to tehdy používaná jednotlivá barviva nedokázala. O dva roky později představil metodu barvení tuberkulózních bacilů methylovou violetí a Koch tento postup převzal do své vlastní práce.

Teorie, která později těmto postupům poskytla společný základ, je samostatnou záležitostí a její časové zařazení se běžně zjednodušuje. Ehrlichova teorie postranních řetězců, tedy představa, že látka působí na buňku proto, že jsou chemicky kompatibilní, patří do 90. let 19. století, nikoli do období pokusů s barvivy. Dřívější práce poskytla předchozí přesvědčení: selektivita je chemická, a proto ji lze cíleně hledat, místo aby na ni člověk náhodou narazil.

Pokus, který z barviva udělal mapu

V roce 1885 Ehrlich vydal monografii o potřebě kyslíku v organismu s podtitulem označujícím ji za barevně analytickou studii. Její metoda spočívala ve vstřikování barviv, jejichž barva závisí na oxidačním stavu, a následném porovnávání toho, jak je různé orgány redukují nebo zachovávají. Barvivo sloužilo jako přístroj, podobně jako teploměr: vypovídalo o podmínkách uvnitř tkáně, které nebylo možné přímo zkoumat. Ehrlich sám formuloval cíl jako stanovení redukční schopnosti živých orgánů pomocí určitých barviv.

Výsledek s methylenovou modří přišel v roce 1886 v článku o reakci barviva s živou nervovou tkání, který byl přednesen lékařské společnosti v prosinci předchozího roku. Methylenová modř byla zavedena do krevního oběhu živého zvířete. Poté byly odebrány tenké řezy tkáně a vystaveny vzduchu, aby se nahromaděné bezbarvé barvivo oxidovalo zpět do modré podoby a ukázalo, kde se soustředilo. Nervové buňky a nervová vlákna se obarvily, a to natolik selektivně, že se tato technika stala standardní metodou zobrazování nervové tkáně. Sloučenina už nebyla jen barvivem nanášeným na mrtvý řez na laboratorním stole. Byla značkou, která se sama rozmisťovala uvnitř živého těla, a její rozložení bylo možné odečíst.

Vlastnost, která stojí za oběma pokusy, si zaslouží jasné vysvětlení, protože na ní závisí celý zbytek tohoto příběhu. Methylenová modř se může vratně přeměňovat. Její redukovaná forma, leukomethylenová modř, je bezbarvá a při kontaktu s kyslíkem se mění zpět na modrý kation. Roztok barviva s glukózou v uzavřené nádobě je bezbarvý; po otevření nádoby zmodrá. Podle dochovaných popisů Ehrlich tuto skutečnost přímo předvedl: působil na obarvené řezy chloridem železitým i vzduchem a sledoval návrat barvy. Barvivo, které mění barvu podle redoxního stavu svého okolí, je sondou do tohoto prostředí.

Vedle sebe tedy stály dvě vlastnosti. Barvivo dokázalo rozlišit jednu tkáň od druhé. A změnou oxidačního stavu bylo možné jeho barvu zapínat a vypínat.

Při zpětném pohledu je druhá vlastnost počátkem chemoterapie. Pokud se sloučenina váže na jeden druh tkáně, ale ne na jiný, mohla by tatáž sloučenina pronikat do jednoho druhu organismu, ale ne do jiného. Ehrlich tento závěr vyslovil přímo: pokud lze patogen selektivně obarvit, může barvení ukazovat na specifické poškození tohoto patogenu. Barvivo by tedy mohlo sloužit jako lék zaměřený na vetřelce, nikoli na pacienta.

První zkouška u pacienta se netýkala malárie. V roce 1890 Ehrlich spolu s psychiatrem Arthurem Leppmannem uvedl, že methylenová modř zmírňuje bolest při neuralgických a revmatických potížích svalů, kloubů a šlach. Oba diskutovali o tom, zda by lék mohl působit na duševní onemocnění, a rozhodli se to nezkoušet. Italský lékař Pietro Bodoni z Janova to přesto zkusil. Název jeho článku z roku 1899 odkazuje na sedativní účinek u různých forem psychózy: popsal zklidnění čtrnácti agitovaných pacientů a poznamenal, že další janovští lékaři již barvivo používají ke stejnému účelu. Sedace není působením na samotné onemocnění a tento rozdíl se v této historii opakovaně objevuje.

Práce týkající se malárie přišla v roce 1891 ve spolupráci s patologem Paulem Guttmannem v berlínské nemocnici Moabit. Methylenová modř byla podána dvěma pacientům a zpráva vyšla v časopise Berliner klinische Wochenschrift dne 28. září 1891. V prvním případě pacient večer 29. června užil najednou 0.5 g barviva; očekávaný záchvat se plně nerozvinul a jedinou následně zaznamenanou obtíží bylo mírné bolestivé močení s modrou močí. Horečnaté záchvaty během prvních dnů vymizely a nejpozději osmý den již v krvi nebyli paraziti. Sami autoři shrnuli, že se jejich očekávání zcela naplnila. Dva případy bez kontrolní skupiny nejsou důkazem. Podrobnější pojednání o methylenové modři a malárii, včetně moderních studií, patří na samostatnou stránku. Zde je zajímavá užší otázka: kolik z Ehrlichovy úvahy obstálo při střetu s parazitem.

Kde úvaha obstála a kde selhala

Z navrženého mechanismu neobstálo mnoho, alespoň ne v podobě, kterou Ehrlich předložil. Úhledná verze, v níž plochý tricyklický kation vklouzne mezi páry bází DNA parazita, u rodu Plasmodium neobstojí. Infikovaná červená krvinka redukuje methylenovou modř tak snadno, že se k parazitovi vůbec nedostane jako planární kation. Vysvětlení založené na interkalaci, které odpovídá akridinovým barvivům, se na toto barvivo nehodí.

To, co důkazy podporují, je méně přehledné. Methylenová modř inhibuje glutathionreduktázu parazita při koncentracích dosažitelných u pacienta. Blokuje přeměnu hemu na hemozoin, inertní pigment, který parazit vytváří, aby se neotrávil produkty vlastního trávení hemoglobinu, přibližně stejně účinně jako chlorochin a mnohem účinněji než chinin. Její redoxní cyklování navíc vytváří reaktivní formy kyslíku v buňce, která je už sama produkuje. Který z těchto mechanismů je skutečně rozhodující, nebo zda přispívají všechny, dosud není vyřešeno.

Je tu další komplikace, která by měla ovlivnit čtení každého historického tvrzení o této sloučenině. Komerční methylenová modř té doby nebyla jedinou látkou. Vzorky obsahovaly azure B, monodemethylovaný kongener, a ve starších roztocích se ho hromadilo více. Azure B je metachromatické barvivo s jinými cíli: dvouvláknovou DNA barví sytě modře a RNA zeleně. Směs dvou barviv s různými místy působení, v poměrech, které nikdo nezaznamenal, nemůže být podkladem pro jednoznačné tvrzení o tom, co v ní dělala methylenová modř.

Samotné barvivo nikdy nevytlačilo chinin. Metoda si vedla lépe. Ehrlichův žák Wilhelm Roehl, který pracoval pro barvářský a farmaceutický koncern IG Farben, nadále prosazoval deriváty barviv jako léky proti tropickým nemocem a poskytl chybějící nástroj: kanára infikovaného ptačí malárií jako rutinní model pro screening kandidátních sloučenin. Werner Schulemann poté upravil postranní řetězec a výsledná fenothiaziniová sůl vyléčila experimentální infekci. Stále však zbarvovala pacienty do modra.

Trvalým výsledkem se nakonec nestalo ani barvivo, ani kruhový systém, nýbrž postranní řetězec. Přidání dialkylaminoalkylaminové skupiny změnilo chování molekuly a tento fragment přežil všechny pozdější úpravy. Zachováte-li tuto skupinu a nahradíte fenothiaziniový kruh akridinem, výsledkem je chinakrin. Dosadíte-li chinolin, výsledkem je chlorochin. Pamachin, primachin a amodiachin, které všechny stále patří mezi antimalarika, nesou tutéž skupinu. Sloučenina, která jako léčba neuspěla, poskytla část, která uspěla.

Spojení s antipsychotiky vede přes kruh, nikoli přes lék. Právě objasnění struktury methylenové modři dovedlo Heinricha Augusta Bernthsena v roce 1883 k základnímu fenothiazinovému jádru. Na této struktuře, různě substituované, pracovali chemici v Rhône-Poulenc ve 40. letech 20. století při hledání antihistaminik. Jedna z těchto sloučenin byla syntetizována přibližně na konci roku 1950 a zkoušel ji chirurg Henri Laborit, který si všiml, že pacienti po ní zůstávají klidní a lhostejní. Její první publikované psychiatrické použití, u pacienta s mánií, přišlo v lednu 1952. První antipsychotikum není ani tak potomkem Ehrlichova antimalarika jako spíše vzdáleným příbuzným barviva, s nímž začínal.

Tři návyky, které stojí za to si z tohoto příběhu uchovat

1. „První syntetický lék používaný v medicíně“ označuje kategorii a nutné výhrady jsou rozsáhlejší, než tato formulace naznačuje. Tato fráze se vžila; hojně citovaný přehled Schirmera a kolegů v časopise Neurobiology of Aging označuje methylenovou modř za vůbec první plně syntetický lék používaný v medicíně. Chloralhydrát byl zaveden jako syntetické sedativum v roce 1869, o více než dvacet let dříve. Část odpovědi poskytuje samotný článek z roku 1891, protože jeho autoři uvádějí syntetická antipyretika, která již proti malárii selhala, mimo jiné chinolin, antipyrin a antifebrin. Ehrlichův vlastní arsenový přípravek proti syfilidě přišel ještě později. Obhajitelná verze tohoto tvrzení se týká spíše metody než prvenství: methylenová modř patří mezi nejranější syntetické sloučeniny vybrané k působení proti konkrétnímu organismu na základě chemické teorie selektivity.
2. Selektivní distribuce není selektivní přínos. Ehrlichův výsledek z roku 1886 ukázal, že barvivo proniká do nervové tkáně. Kam se sloučenina dostane a co tam po příchodu dělá, jsou dvě různá měření a první z nich je mnohem snazší provést. Právě v této mezeře se od té doby pohybuje většina tvrzení o methylenové modři a mozku.
3. Čistota patří k důkazům, nikoli k marketingu. Historické záznamy jsou nejednoznačné právě z tohoto důvodu. Drobné strukturní rozdíly mění to, kam tato sloučenina proniká. Proto musí být certifikát analýzy vázán na konkrétní šarži, nikoli předkládán jen jako prohlášení, že výrobek byl testován. Prodejce, který tvrdí shodu s lékopisnou monografií, ale testuje pouze těžké kovy, tvrdí více, než jeho zpráva dokládá. Blupreme odebírá methylenovou modř od farmaceutického výrobce a testuje celou specifikaci stanovenou monografií: totožnost, čistotu, organické nečistoty, zbytková rozpouštědla, elementární nečistoty, zbytek po žíhání, mikrobiální limity a bakteriální endotoxiny. Zpráva je zveřejněna u výrobku a stránka o methylenové modři jakosti USP vysvětluje tyto limity i to, proč je výsledek pro azure B první, který je třeba hledat.

Chronologický přehled pramenů

Chronologická posloupnost milníků, včetně chemie barviv před Ehrlichem a jakostních tříd a specifikací po něm, je samostatně popsána v historii methylenové modři. Samotnou identitou sloučeniny se zabývá článek co je methylenová modř.

Obrazové přílohy, z nichž toto pojednání vychází a které byly reprodukovány v přehledu Kraftsové, Hempelmannové a Skórské-Stanii z roku 2012, nejsou rovnocenné. Jeden příklad ukazuje proč. Obrazová příloha z roku 1891 je primárním záznamem zkoušky; portrét z roku 1910 vedle ní dokládá tehdejší věhlas a nic víc. Stránky z Andersagova zápisníku z roku 1934 jsou přímou stopou chinolinové substituce, zachycenou vlastní rukou chemika.

Poctivé shrnutí Ehrlichových pokusů s barvivy zní: správně určil selektivitu i cíl, ale mýlil se v mechanismu. Methylenová modř se skutečně koncentruje v nervové tkáni a skutečně poškozuje původce malárie. Druhé však není důsledkem prvního a chemické vysvětlení, které nabídl pro obojí, bylo nesprávné. To, co nesporně prokázal, mělo trvalejší hodnotu než správný mechanismus: sloučeninu lze cíleně vybrat, nikoli jen objevit, a vybrat ji na základě důkazů shromážděných ještě předtím, než ji kdokoli podá pacientovi.