Methylenová modř, tau a amyloid: proč se mechanismy odstraňování proteinů liší

Zeptejte se, co methylenová modř dělá s proteiny spojenými s Alzheimerovou chorobou, a uslyšíte jednu sebejistou odpověď tam, kde by měly zaznít tři odpovědi s jasným vymezením. Ve zkumavce brání tomu, aby se tau vázal sám na sebe. V jednom myším modelu snižuje rozpustný amyloid, zatímco tau nechává beze změny. V jiném tlumí enzym, který amyloid vůbec vytváří. Každý z těchto nálezů je skutečný. Žádný ale nevystihuje celý obraz a všechny tyto děje neprobíhají u téhož zvířete současně. Tento článek je odděluje, aby se výsledek jednoho experimentu přestal citovat jako důkaz výsledku jiného.

Čtenáři, kteří chtějí širší přehled o tom, jak methylenová modř působí uvnitř buněk, by měli začít tam. Čtenáři, kteří chtějí vědět, zda něco z toho pomohlo pacientům, by si měli přečíst přehled klinických výsledků u Alzheimerovy choroby, kam výsledky studií u lidí patří. Tento článek tento přehled neopakuje.

Nález týkající se tau patří k testům agregace

Nejstarší ze tří příběhů vychází z bezbuněčných experimentů s tau, proteinem, který tvoří neurofibrilární klubka. V testu vazby tau–tau se fragmenty tau skládají do párových helikálních filament a fenothiazinová barviva včetně methylenové modři toto skládání blokují při nízkých mikromolárních koncentracích. Pozdější biochemické práce přinesly chemické vysvětlení: barvivo oxiduje cysteinové zbytky v tau, čímž stabilizuje monomerní formu a potlačuje vznik fibril, které by jinak rostly. Uváděné koncentrace inhibující agregaci tau se pohybují přibližně od jednotek po nižší desítky mikromolů na litr, což je rozmezí důležité pro vše, co následuje.

Všimněte si, o jaký typ tvrzení jde. Neříká nic o tvorbě tau, fosforylaci tau v živém mozku ani o odstraňování tau. Říká, že za definovaných podmínek ve zkumavce oxidované barvivo brání skládání tau. To je přesný, úzce vymezený a užitečný výsledek. Problém začíná, když se rozšíří na obecné tvrzení, že methylenová modř odstraňuje patologické změny spojené s tau, protože údaje ze zvířecích experimentů tuto verzi nepodporují.

Nález týkající se proteazomu patří k myším 3xTg-AD a oddělil amyloid od tau

Nejjasnějším experimentem s rozdílnými výsledky pro jednotlivé ukazatele je 16týdenní studie podávání v krmivu u myší nesoucích tři mutace spojené s Alzheimerovou chorobou. Zvířata od věku šesti měsíců dostávala krmivo obsahující methylenovou modř a výzkumníci současně měřili tři věci: proteazom, hladiny amyloidu a tau.

U proteazomu nastala změna. Aktivita podobná chymotrypsinu vzrostla přibližně o čtvrtinu a aktivita podobná trypsinu přibližně o polovinu, zatímco třetí katalytická aktivita se významně nezměnila. Rozpustný amyloid-beta 40 i 42 klesl přibližně o čtvrtinu. Autoři to interpretovali jako zvýšené odstraňování, nikoli sníženou tvorbu, protože prekurzorový protein ani fragmenty vznikající jeho zpracováním se nezměnily; zároveň se zlepšilo učení a paměť v retenčním testu vodního bludiště.

A pak přišly rozdíly mezi ukazateli. Nerozpustný amyloid se nezměnil. Barvení plaků se nezměnilo. Celkové množství lidského tau ani fosfo-tau na threoninu 181 se nezměnilo a nezměnila se ani nesprávná lokalizace tau. Beze změny zůstaly také mitochondriální ukazatele: nebyl zjištěn významný vliv na aktivitu cytochrom-c oxidázy, množství proteinu této oxidázy ani na ATP. V tomto modelu a při tomto režimu tedy methylenová modř zvýšila dvě ze tří aktivit proteazomu, snížila rozpustný amyloid, zlepšila behaviorální ukazatel a ponechala ukazatele tau, nerozpustný amyloid i testované mitochondriální ukazatele beze změny.

Jedno upozornění tuto pointu spíše zpřesňuje, než oslabuje. U těchto myší se v testovaném věku ještě nevytvořily agregáty tau, takže experiment nemůže ukázat, že methylenová modř proti klubkům tau nefunguje. Ukazuje, že rozpustný amyloid může klesnout, zatímco měřené ukazatele tau zůstávají beze změny. Přesně takový výsledek, kdy se jeden protein změnil a druhý ne, toto téma potřebuje. Pokud jste sem přišli s přesvědčením, že aktivace proteazomu methylenovou modří odstraňuje oba charakteristické proteiny společně, tato studie tuto představu opravuje.

Nález týkající se tvorby amyloidu patří ke starým myším PSAPP a odporuje předchozímu mechanismu

Jiná skupina, jiný model a opačné vysvětlení dějů předcházejících změně amyloidu. V tříměsíční studii podávání žaludeční sondou u 15měsíčních myší PSAPP snížila denní perorální dávka 3 mg/kg zátěž plaky v různých oblastech mozku přibližně o třetinu až polovinu a snížila několik frakcí amyloidu, včetně oligomerů měřených specializovaným testem. Zde však navrhovaným mechanismem byla snížená tvorba, nikoli rychlejší odstraňování: množství proteinu BACE1 v mozku kleslo, jeho produkt C99 také klesl, ale messengerová RNA nikoli. To ukazuje na účinek na úrovni proteinu, nikoli na nižší genovou expresi.

Experimenty na buňkách tuto interpretaci dále podpořily. V bezbuněčném testu s rekombinantním enzymem methylenová modř přímo inhibovala BACE1 a v buňkách křeččích ovarií exprimujících lidský prekurzorový protein amyloidu klesalo množství vylučovaného amyloidu 40 a 42 už při koncentracích 1.56 mikromolu na litr, zatímco samotný prekurzor zůstával beze změny. Porovnejte to s předchozí studií, v níž se fragmenty vznikající zpracováním prekurzoru nezměnily a vysvětlením bylo odstraňování. Obě studie nemohou popisovat tentýž univerzální mechanismus, protože se liší modely, věk, dávky, způsoby podání i délka podávání. Právě o to jde. Účinky methylenové modři na amyloid v jednom experimentálním uspořádání probíhají přes tvorbu a v jiném přes odstraňování. Citovat kterýkoli z těchto výsledků bez jeho experimentálního kontextu je zavádějící.

Jedna chemie, několik cílů: propojení přes oxidaci cysteinu

Třetí směr výzkumu vysvětluje, jak se jediný redoxní chemický mechanismus může objevit v jinak nesouvisejících příbězích o proteinech. V biochemické studii inhibice kaspáz methylenová modř inaktivovala kaspázu-6 oxidací jejího katalytického cysteinu na kyselinu sulfenovou, což bylo potvrzeno hmotnostní spektrometrií. Koncentrace pro poloviční maximální účinek byla přibližně 10.6 mikromolu na litr. Kaspáza-3 byla inhibována při podobné koncentraci. Autoři tento nález výslovně propojili s literaturou o tau: stejný chemický mechanismus oxidace cysteinu, který má podle navrženého vysvětlení udržovat tau v monomerní podobě, může vyřadit cysteinovou proteázu a účinné koncentrace se překrývají.

Je to elegantní a zároveň varovné. Redoxně aktivní molekula, která oxiduje přístupné cysteiny, bude mít při jakékoli účinné koncentraci více než jeden cíl. Příběh rozpadu agregátů tau, příběh kaspáz a možná i další sdílejí stejný chemický děj, ale týkají se různých proteinů. Tento společný děj neznamená, že jsou nálezy zaměnitelné. Znamená to, že dávka a kontext rozhodují o tom, který cíl je důležitý, a že dlouhodobé podávání zaměřené na jeden proces závislý na cysteinu může zasáhnout i další procesy. Autoři studie kaspáz na tuto možnost přímo upozornili. Související otázky, jak redoxní chemie methylenové modři určuje výběr jejích cílů, co aktivace proteazomu znamená pro jiné agregované proteiny a zda dlouhodobé podávání mění profil cílových struktur, si každá zaslouží samostatné zpracování.

Mechanismus podle sledovaného ukazatele: který nález patří ke kterému modelu

Čtěte tabulku řádek po řádku a poučení je zřejmé. Ani v jednom řádku nenastává změna ve všech sloupcích. Nejsilnější výsledek týkající se tvorby amyloidu pochází ze studie, která proteazom vůbec netestovala. Nejsilnější výsledek týkající se proteazomu pochází ze studie, v níž se zpracování prekurzoru vůbec nezměnilo. Nález týkající se tau pochází převážně ze zkumavek a z chemického mechanismu sdíleného s enzymy mimo zamýšlený cíl. Kdokoli tyto sloupce sloučí do jediného tvrzení, že methylenová modř odstraňuje patologické proteiny jako celou skupinu, píše přehled experimentu, který nikdy neproběhl.

Stejná důslednost platí i pro pacienty. Zda tyto mechanismy společně přinášejí klinický přínos, je samostatná otázka s vlastními studiemi a vlastními závěry. Odpověď najdete v přehledu klinických důkazů u Alzheimerovy choroby, nikoli zde.