Methylenová modř a roztroušená skleróza: co zkoumal výzkum na zvířatech

Když hledáte informace o methylenové modři u roztroušené sklerózy, narazíte na články, které zdánlivě odpovídají na stejnou otázku. Ve skutečnosti tomu tak není. V jedné studii podávali methylenovou modř nemocným myším jako léčbu. Ve druhé jí žádné zvíře neléčili. Použili ji jako modré barvivo na tenkých řezech míchy, aby patolog mohl pod mikroskopem vidět myelin.

Na tomto rozlišení stojí celý článek. Barvivo má v biologii dvě role, které kromě lahvičky nemají nic společného. Jako kandidátní léčivo se podává živému zvířeti a zkoumá se, zda se onemocnění mění. Jako barvivo se po skončení experimentu nanáší na mrtvou fixovanou tkáň a zkoumá se, jak tkáň vypadala. Pokud tento rozdíl přehlédnete, budete oddíl popisující metody patologického vyšetření číst, jako by šlo o výsledek léčby.

Co je EAE, jednoduše řečeno

Experimentální autoimunitní encefalomyelitida, obvykle zkracovaná jako EAE, je standardní zvířecí model některých aspektů roztroušené sklerózy. Výzkumník imunizuje vnímavou myš fragmentem myelinového proteinu spolu se silným adjuvans. Imunitní systém poté napadne vlastní centrální nervový systém zvířete. U myši se rozvíjí vzestupná slabost, kterou lze snadno hodnotit na škále od 0 do 5, od ochablého ocasu až po ochrnutí zadních končetin.

Snadnost tohoto hodnocení vysvětluje, proč je EAE oblíbená, ale také proč může být zavádějící. Roztroušená skleróza u lidí vzniká spontánně, zahrnuje širší a méně přesně vymezený soubor cílových struktur a projevuje se zrakovými, senzitivními, kognitivními, mozečkovými a motorickými příznaky při relabujícím nebo progresivním průběhu. EAE za kontrolovaných podmínek reprodukuje vybrané mechanismy, například zánět, demyelinizaci a poškození axonů. Nereprodukuje roztroušenou sklerózu v malém měřítku. Čtenáři, kteří chtějí znát obecný rámec, se mohou před posouzením jakéhokoli jednotlivého tvrzení o onemocnění seznámit s předpokládaným působením methylenové modři na buněčné úrovni.

Obě níže uvedené studie navíc používaly odlišné antigeny k vyvolání EAE, což je podstatné. Léčebná studie vyvolala onemocnění pomocí MOG35-55, krátkého peptidu z myelinového oligodendrocytárního glykoproteinu. Patologická studie vyvolala onemocnění pomocí MP4, fúzního proteinu tvořeného úseky bazického myelinového proteinu a proteolipidového proteinu. Volba kmene a antigenu mění místa výskytu lézí i chování zánětu, takže nejde o dvě opakování stejného experimentu.

Přehled: od modelu přes otázku k omezením

Mějte tuto tabulku po ruce. Je základním přehledem pro tento článek. Každý řádek uvádí, na jakou klinickou otázku může model odpovědět, co se skutečně měřilo a kde končí možnost přenosu výsledků.

Každý, kdo bude ověřovat další titulek, může použít stejné sloupce s pomocí článku jak číst preklinické studie: zjistěte živočišný druh a antigen, roli látky, sledované ukazatele a to, zda výsledek popisuje průběh onemocnění, nebo momentální stav tkáně.

Výsledek léčebné studie: co podávání změnilo

Léčebná studie z roku 2016 v časopise Journal of Neuroimmunology použila samice myší C57BL/6 ve věku přibližně 8 až 10 týdnů, imunizované 250 mikrogramy MOG35-55 na myš. Po vyvolání onemocnění byla zvířata s EAE náhodně rozdělena do skupiny s methylenovou modří nebo do neléčené skupiny s EAE a klinická skóre byla sledována přibližně do dne 30.

Klinická skóre byla u léčených myší od dne 15 do dne 30 významně nižší než u kontrolních myší s EAE, při P menším než 0.01. Analýza míchy ukázala stejný směr: u léčených zvířat bylo méně zánětlivé infiltrace, méně demyelinizace a menší úbytek axonů.

Výraznou součástí studie byl soubor sledovaných signálních ukazatelů. Léčba zvýšila aktivaci AMPK a expresi SIRT1 a potlačila aktivaci NF-kB, ústředního regulátoru zánětu. V oblasti adaptivní imunity snížila odpověď Th17 a posílila odpověď Treg. Navrhovaný řetězec tedy vede od methylenové modři přes AMPK a SIRT1 ke snížení signalizace NF-kB, dále k posunu od zánětlivých Th17 směrem k regulačním Treg, k mírnějšímu poškození tkáně a k nižším skóre.

Tento řetězec je interpretací, nikoli prokázanou příčinnou posloupností. Studie ukazuje, že podávání léčiva, změny signalizace a zlepšení onemocnění probíhají společně. Nedokazuje, že AMPK a SIRT1 zprostředkovávají celý přínos, a veřejně indexovaný text neuvádí přesnou dávku v miligramech na kilogram, cestu podání, den zahájení ani dobu podávání natolik jasně, aby bylo možné režim reprodukovat pouze podle abstraktu. Jakýkoli údaj o dávkování z této studie uváděný na prodejní stránce považujte za neověřený, pokud neodkazuje na metodiku v plném textu. V širším souboru důkazů o methylenové modři u lidí je vhodné ověřit, zda tento časný signál ovlivnění imunity někdy vedl ke klinickým údajům.

Výsledek patologické studie: co ukázalo šest měsíců sledování tkáně

Studie MP4 z roku 2015 v časopise PLoS ONE použila samice myší C57BL/6 imunizované 200 mikrogramy MP4 v kompletním Freundově adjuvans spolu s pertusovým toxinem v den imunizace a znovu o 48 hodin později. Žádné zvíře nedostalo methylenovou modř jako léčivo. Po fixaci a zalití byly příčné řezy míchy o tloušťce jeden mikrometr obarveny methylenovou modří pro světelnou mikroskopii; jemnější detaily ventrolaterálního provazce byly zkoumány elektronovou mikroskopií.

Tkáně byly odebírány ve třech fázích: při akutním vrcholu u 7 myší, tři měsíce po nástupu onemocnění u 5 myší a šest měsíců po nástupu u 10 myší. Průměrná klinická skóre v těchto fázích vypadala téměř totožně, přibližně 1.7 až 1.8 na škále od 0 do 5. Tkáň ale vypovídala o něčem jiném. Izolované poškození myelinu vzrostlo z přibližně 569,000 vláken na čtvereční milimetr při akutním vrcholu na přibližně 1,496,000 po šesti měsících; rozdíl mezi akutní a dlouhodobou fází byl významný při P rovném 0.027. Kombinované poškození myelinu a axonů se do šesti měsíců přibližně zdvojnásobilo. Podíl remyelinizujících vláken zůstal v každé fázi pod jedním procentem, což je střízlivý údaj pro naděje na obnovu.

Poškození axonů mělo průběh ve tvaru U: bylo vysoké při akutním vrcholu, nižší po třech měsících a nejvyšší po šesti měsících. Korelovalo s otokem mitochondrií a se zmenšenými rozestupy mezi neurofilamenty. Hodnocení probíhalo zaslepeně vůči skóre a fázi onemocnění, což posiluje závěr, že klinická skóre podhodnocovala pokračující strukturální poškození.

Právě tento nesoulad je skutečným přínosem studie pro čtenáře zajímajícího se o roztroušenou sklerózu. Stabilní skóre postižení neznamenalo stabilní stav tkáně. Zároveň ukazuje, proč tento článek nemůže podpořit žádné tvrzení o léčbě roztroušené sklerózy methylenovou modří. Zkoumal vliv času, nikoli léčbu.

Proč ani jedna studie neprokazuje přínos pro pacienty

Vnímejte každý článek jako dobrou odpověď na úzce vymezenou otázku, ale nikoli jako odpověď na otázku přínosu pro pacienty.

Zaprvé se liší příčina. EAE se záměrně vyvolává definovaným antigenem a adjuvans. Roztroušená skleróza u lidí vzniká spontánně a zapojuje širší imunitní repertoár, který zahrnuje T buňky, B buňky, vrozenou imunitu a rezidentní gliové buňky. Látka, která u myši mění odpověď zaměřenou na MOG, nemusí změnit tuto širší odpověď u lidí.

Zadruhé se liší fenotyp. Vzestupná slabost postupující u myši od ocasu k zadním končetinám je praktickým měřitelným ukazatelem. Různorodost lidské roztroušené sklerózy redukuje na jediné číslo vyjadřující motorické postižení. Léčiva běžně mění krátkodobá skóre EAE, aniž by měnila průběh onemocnění u lidí. Proto je EAE nástrojem pro screening a zkoumání mechanismů, nikoli klinickou praxí v malém měřítku.

Zatřetí zůstávají nevyřešené expozice a načasování. Průběžné podávání zahájené časně v 30denním pokusu na myších není totéž jako dlouhodobé perorální užívání u člověka s již rozvinutým onemocněním a ani jedna studie neměřila hladiny léčiva v nervovém systému. Bez tohoto spojovacího článku nelze přejít od koncentrace na laboratorní destičce nebo dávky u myši k režimu podávání u člověka.

Začtvrté tyto dva články navzájem nereplikují své výsledky. Liší se antigeny, otázkami i sledovanými ukazateli a v jednom případě vůbec nešlo o léčbu. Citovat je společně jako dvě pozitivní studie léčby roztroušené sklerózy je záměna odlišných kategorií výzkumu.

Co to znamená pro čtenáře posuzující důkazy

Tyto články neposkytují žádný zavedený protokol použití methylenové modři u roztroušené sklerózy. Léčebná studie podporuje další výzkum AMPK, SIRT1, NF-kB a rovnováhy Th17 a Treg u MOG EAE. Patologická studie připomíná, že poškození tkáně může postupovat, i když skóre zůstávají zdánlivě beze změny, a že methylenová modř v oddílu metod někdy znamená nádobu s barvivem, nikoli lékárničku. Čtenáři sledující probíhající výzkum roztroušené sklerózy by měli mít toto rozlišení mezi barvivem a léčivem na paměti. Otázky bezpečnosti, včetně rizik pro krev a rizik interakcí, patří do rozhovoru s lékařem spolu s obecnými údaji o bezpečnosti methylenové modři, než kdokoli začne jednat na základě titulků o laboratorním výzkumu.

Závěr se vejde do jedné věty. Jedna citovaná studie podávala methylenovou modř myším s MOG EAE a zaznamenala mírnější onemocnění spolu s protizánětlivým posunem imunitní odpovědi, zatímco druhá citovaná studie nepodávala žádnou léčbu a používala methylenovou modř pouze k barvení míchy při dokumentování šesti měsíců hromadícího se poškození myelinu a axonů, takže tato dvojice studií neprokazuje, že methylenová modř pomáhá při roztroušené skleróze u lidí.