Může methylenová modř obejít mitochondriální komplex III? Proč se studie rozcházejí

Dvě laboratoře zkoumaly, zda methylenová modř dokáže obejít zablokovaný mitochondriální komplex III. Jedna odpověděla ne. Druhá ano. Obě měly data.

První studie na mitochondriích z myšího mozku zjistila, že to barvivo nedokáže. Druhá, provedená na mozkových mitochondriích tří druhů hlodavců, zjistila, že to částečně dokáže. Třetí studie na myších játrech se v této souvislosti často cituje, ale testovala něco jiného. Pokud ji zařadíme do správného kontextu, polovina nejasností zmizí.

Nelze zde vyhlásit žádný univerzální mechanismus. Jde o tři experimenty s různými blokátory, dávkami a měřenými ukazateli. Nejprve si přečtěte podmínky. Závěry z nich vyplynou.

Co zde znamená obcházení

Elektrony vstupují do řetězce přes komplex I (z NADH) nebo komplex II (ze sukcinátu), procházejí přes komplex III k cytochromu c a potom přes komplex IV ke kyslíku. Gradient vytvořený během tohoto procesu buňka využívá k tvorbě ATP.

Tvrzení o obcházení znamená, že methylenová modř přijímá elektrony před místem blokády a předává je za ním. Oxidované barvivo přijímá elektrony z NADH nebo z počátečních složek řetězce a mění se na leukomethylenovou modř. Redukovaná forma je pak předává cytochromu c nebo zpět do řetězce. Pokud k předání dojde za místem blokády, respirace a membránový potenciál se částečně obnoví. Pokud k němu dojde v místě blokády nebo před ním, neobnoví se nic.

O velké části tohoto sporu rozhoduje jeden detail komplexu III. Komplex provozuje Q-cyklus se dvěma vazebnými místy pro inhibitory. Antimycin se váže na místo Qi. Myxothiazol se váže na místo Qo. Studie, která používá pouze jeden z nich, otestovala jen polovinu komplexu.

První studie: žádné obcházení v mitochondriích z myšího mozku

Gureev a kolegové použili mitochondrie z mozkové kůry myší C57BL/6, izolované digitoninem, a měřili je při koncentraci 0.1 mg proteinu na ml. Substráty zahrnovaly tři režimy: pyruvát s malátem, každý v koncentraci 5 mM, sukcinát v koncentraci 10 mM s glutamátem v koncentraci 2 mM a L-prolin v koncentraci 10 mM. Blokátory byly rotenon v koncentraci 1 micromolar (komplex I) a antimycin v koncentraci 1 mikrogram na ml (komplex III). Dávky barviva byly 0.5, 1 a 2 micromolar, přičemž hlavní koncentrací byla 1 micromolar. Metody a záznamy měření jsou uvedeny ve sdělení v časopise FEBS Letters.

Obcházení komplexu I fungovalo. Rotenon snížil respiraci stimulovanou ADP z přibližně 121 na přibližně 2 nmol za minutu na mg a barvivo v koncentraci 1 micromolar ji obnovilo na přibližně 21. Membránový potenciál se obnovil při použití pyruvátu s malátem i L-prolinu.

Obcházení komplexu III nefungovalo. Antimycin snížil respiraci na přibližně 16 a barvivo ji zvýšilo pouze na přibližně 20. Membránový potenciál se neobnovil při žádném substrátu, a to ani při dávkách barviva až 5 micromolar. Údaje o peroxidu ukazovaly stejným směrem: samotné barvivo zvýšilo uvolňování peroxidu z bazální rychlosti kolem 76 pmol za minutu na mg na zhruba 1170, 1460 a 1945 při uvedených třech dávkách, ale antimycin tento signál vyvolaný barvivem snížil přibližně o 25, 88 a 96 procent. Kdyby redukované barvivo reagovalo přímo s kyslíkem, blokáda komplexu III by signál neměla potlačit. Autoři usoudili, že se redukované barvivo oxiduje v místě Qo komplexu III, před místem blokády antimycinem. Krátká smyčka, vyjádřená slovy: od donorů k barvivu, od barviva k Qo, dále běžnou cestou. Blokáda rotenonem se obejde. Blokáda antimycinem nikoli.

Druhá studie: částečné obcházení u tří druhů a na obou místech působení inhibitorů

Svab a kolegové rozšířili experimentální uspořádání. Použili mozkové mitochondrie myší, potkanů a morčat, izolované pomocí Percollu, a měřili je při stejné koncentraci 0.1 mg na ml, s pyruvátem a malátem nebo glutamátem a malátem, vždy po 5 mM. Použili dva blokátory komplexu III: antimycin A v koncentraci 0.3 micromolar a myxothiazol v koncentraci 1 micromolar. Ve většině měření mělo barvivo koncentraci 2 micromolar, při pokusech s cytochromem c pak 0.5. Všechny tři druhy se shodnými protokoly popisuje volně dostupný článek.

Obě blokády byly částečně obejity, a to u všech tří druhů. V myších mitochondriích antimycin potlačil respiraci a barvivo ji zvýšilo přibližně o 60 procent, ze zhruba 37 na 59 nmol za minutu na mg. Myxothiazol ji potlačil o 88 procent, na přibližně 4.5, a barvivo ji zvýšilo pětinásobně na přibližně 23. Při obou inhibitorech se membrána částečně repolarizovala. Potenciál byl měřen dvěma barvivy (safraninem O a poměrovým měřením TMRM), aby se vyloučily optické artefakty.

Tento článek také přímo testoval předávání elektronů, což první studie neprovedla. Exogenní acetylovaný cytochrom c v koncentraci 25 micromolar nebyl redukován energizovanými mitochondriemi ani za přítomnosti inhibitorů, ani bez nich, ale přidání barviva vyvolalo redukci v obou případech. V bezbuněčném pufru NADH spolu s barvivem redukovaly cytochrom c rychlostí úměrnou koncentraci NADH. Delší přeskok, vyjádřený slovy: redukční ekvivalenty k barvivu, od barviva přímo k cytochromu c, přes komplex IV ke kyslíku. Tato cesta zcela vynechává komplex III, takže lze obejít oba blokátory.

Tento výklad podporují dva další měřené ukazatele. Po přidání barviva k mitochondriím ošetřeným myxothiazolem poklesla fluorescence NAD(P)H, což znamená, že redukční ekvivalenty odcházely novou cestou. Absorbance barviva při 660 nm zaznamenávala postupně každý přídavek, zatímco supernatanty získané centrifugací ukázaly, že se oxidované barvivo uvnitř energizovaných mitochondrií koncentrovalo více než stonásobně a po zhroucení potenciálu je opouštělo. Odpovídá tomu i protonová bilance: vynechání kroků spojených s čerpáním protonů ponechává přibližně 2 protony na pár elektronů místo 10. Rychlejší spotřeba kyslíku při jen částečné repolarizaci tedy odpovídá skutečnému obcházení, není důkazem proti němu.

Stejný preparát vykazoval reakce, které ukazují, proč nestačí zběžné čtení. Při kombinaci inhibitoru s barvivem ADP respiraci snižoval místo toho, aby ji zvyšoval, a blokáda transportu ji stimulovala místo zpomalování, zatímco membránový potenciál se stále měnil obvyklými směry. Samotná spotřeba kyslíku je v tomto systému zavádějící.

Třetí studie: studie na játrech, která testovala komplexy I a II, nikoli III

Lee a Boelsterli použili mitochondrie z myších jater a kultivované hepatocyty poškozené efavirenzem (komplex I, IC50 kolem 30 micromolar) a hydrazinem, metabolitem isoniazidu (komplex II, IC50 kolem 30 micromolar). Barvivo v koncentraci přibližně 30 micromolar obnovilo oxidaci NADH, membránový potenciál a ATP a zároveň snížilo množství oxidantů a nekrotickou buněčnou smrt. Článek v časopise Redox Biology tento jev modeluje jako přenos elektronů barvivem, který obchází poškozené komplexy I a II.

Tento výsledek představuje potvrzený kontext týkající se dřívější části řetězce a o komplexu III nic nevypovídá, protože v něm nebylo nic zablokováno. Nemůže potvrdit ani vyvrátit žádnou z obou studií na mozkových mitochondriích.

Přehled podmínek

Čtyři důvody, proč mohou mít obě studie komplexu III ve svých podmínkách pravdu

1. Blokátory nepředstavovaly stejný zásah. Samotný antimycin v koncentraci 1 mikrogram na ml oproti antimycinu v koncentraci 0.3 micromolar a samostatnému blokátoru místa Qo. Cesta, při níž barvivo přivádí elektrony do místa Qo, selhává právě tam, kde uspěje cesta přímo k cytochromu c. Jedno místo nemůže zastupovat obě.

2. Lišila se dávka barviva i načasování. Hlavní koncentrace 1 oproti 2 micromolar u látky procházející redoxním cyklem, jejíž příjem a přímá redukce cytochromu c závisejí na koncentraci a čase. Malé rozdíly v dávce spolu s odlišným načasováním měření mohou odhalit různé větve jedné sítě.

3. Lišily se preparáty. Izolace digitoninem oproti izolaci v gradientu Percollu vybírá překrývající se, ale ne totožné populace mitochondrií. Koncentrace proteinu byla shodná, 0.1 mg na ml, takže tato proměnná odpadá, ale subpopulace a integrita mitochondrií nikoli. Podezření na vliv druhu se navíc nepotvrdilo: druhá skupina reprodukovala svůj fenotyp i u myši.

4. Substrátové podmínky určují, co barvivo dokáže. Tři substrátové režimy oproti dvojicím substrátů napojeným na NADH. Dostupnost NADH a membránový potenciál společně určují, jak rychle se barvivo redukuje a kam se distribuuje. Cesta, která vyžaduje redukované barvivo vedle oxidovaného cytochromu c, je na této volbě závislá.

Jak číst další tvrzení o obcházení

Ptejte se, který komplex byl zablokován, jakým inhibitorem, na kterém místě a při jaké dávce. Ptejte se na koncentraci barviva a na dobu provedení měření. Ptejte se na tkáň, druh, izolaci, koncentraci proteinu a substrát. A ptejte se, zda se shodují výsledky měření potenciálu, respirace, redoxního stavu a přímého testu předávání elektronů, protože samotná spotřeba kyslíku zde více než jednou ukazovala nesprávným směrem.

Úzce vymezené shrnutí obstojí. Na obcházení komplexu I barvivem panuje shoda. U komplexu III myší mitochondrie s antimycinem v koncentraci 1 mikrogram na ml a barvivem v koncentraci 1 micromolar nevykazují funkční obcházení, zatímco tři druhy s antimycinem v koncentraci 0.3 micromolar nebo myxothiazolem v koncentraci 1 micromolar a barvivem v koncentraci 2 micromolar vykazují částečné obcházení s přímým přenosem elektronů z barviva na cytochrom c. Tato tvrzení mohou platit současně. Cokoli obecnějšího je extrapolace.

Související četba zasazuje sporné tvrzení do rámce nesporné chemie: jak methylenová modř přenáší elektrony vysvětluje předávání elektronů, experimenty s obcházením komplexu I popisují potvrzený případ v dřívější části řetězce, měření membránového potenciálu a jejich artefakty objasňují, proč byla potřeba dvě barviva, a laboratorní práce s látkami procházejícími redoxním cyklem přibližuje úskalí dávkování a načasování.