Methylenová modř a ferroptóza: železo, peroxidace lipidů a buněčná smrt

Ferroptóza je buněčná smrt způsobená poškozením membrány. Polynenasycené tuky v membránách oxidují v řetězové reakci, membrána přestane fungovat a buňka zemře. Tyto chemické děje vyžadují železo. Tato věta vystihuje celý koncept a vše v tomto článku zkoumá jednu z jeho částí.

Otázka je zde užší: jak methylenová modř ovlivňuje tento řetězec v buněčných experimentech a co takový výsledek skutečně ukazuje. Stručná odpověď zní, že ve dvou laboratorních studiích methylenová modř v nanomolárních koncentracích snížila peroxidaci mitochondriálních lipidů a udržela buňky naživu po působení spouštěčů, které jinak vyvolávají ferroptózu. Podrobnější odpověď je důležitější, protože každý článek řetězce byl zkoumán jiným zásahem a každý zásah má svá omezení.

Ferroptóza v jednom odstavci

Membránový fosfolipid s řetězcem polynenasycené mastné kyseliny má slabé místo: atomy vodíku, které lze snadno odštěpit. Jakmile radikál jeden z nich odštěpí, na lipid se naváže kyslík, vznikne lipidový peroxylový radikál a ten odštěpí vodík z dalšího lipidu. Reakce se šíří podél membrány, pokud ji něco nezastaví.

Hlavní brzdou je enzym nazývaný GPX4, který využívá glutathion k redukci lipidových peroxidů na neškodné lipidové alkoholy. Laboratorní spouštěče napadají tuto obranu v přesně vymezených bodech. Erastin blokuje vstup cystinu prostřednictvím systému xc-minus, čímž buňku připravuje o cystein potřebný pro syntézu glutathionu. Buthioninsulfoximin blokuje syntézu glutathionu přímo. RSL3 inhibuje samotný GPX4. Všechny tři způsobují, že peroxidy zůstávají neodstraněné, ale působí v různých krocích, takže výsledek s jedním spouštěčem nelze automaticky zobecnit na ostatní.

Ferroptóza se od apoptózy liší svými určujícími vlastnostmi. Neprobíhá při ní kaspázová kaskáda a nevznikají apoptotická tělíska. Chelátory železa, jako je deferoxamin, a látky zachycující radikály, jako je ferrostatin-1, ji potlačují. Právě tento praktický test vědci používají, aby buněčnou smrt označili za ferroptotickou, a nikoli pouze nekrotickou. Širší přehled drah regulované buněčné smrti zasazuje toto rozlišení do kontextu a způsob, jakým buňky nakládají s labilním železem, vysvětluje, proč je chelatace tak zásadním kontrolním zásahem.

Jakou roli hrají mitochondrie a proč byla sporná

První práce uváděly, že ferroptóze podléhají i buňky bez mitochondriální DNA, což naznačovalo, že mitochondrie nejsou nezbytné. Pozdější práce zjistily, že odstranění mitochondrií nebo zablokování respirace může potlačit ferroptózu způsobenou nedostatkem cysteinu, ale nikoli přímou inhibicí GPX4. Oba výsledky mohou být pravdivé, pokud příspěvek mitochondrií závisí na spouštěči, typu buňky a místě, kde probíhá rozhodující peroxidace.

Studie, o kterou se tento článek opírá, přistoupila ke sporu pomocí sondy specifické pro určitý buněčný kompartment. MitoCLox je mitochondriálně cílená verze indikátoru peroxidace lipidů: při kontaktu s lipidovými peroxylovými radikály uvnitř mitochondrií mění fluorescenci. Ve fibroblastech vystavených erastinu se oxidace mitochondriální sondy objevila v dosud živých buňkách před jejich smrtí a v rámci buněčné populace byla různorodá. Na tomto časovém pořadí záleží. Peroxidace, která předchází smrti, je možnou příčinou. Peroxidace naměřená pouze v mrtvých buňkách je pozůstatkem rozpadu. Doprovodný průvodce metodami měření peroxidace lipidů a tím, co jednotlivé sondy ukazují vysvětluje, proč umístění sondy rozhoduje o významu signálu.

Stejný průběh se objevil i ve druhém modelu. Fibroblasty pacienta s Leberovou hereditární optickou neuropatií, které nesou mutaci komplexu I a mají vyšší výchozí oxidační stres, po vyčerpání glutathionu zemřely ferroptózou, zatímco kontrolní fibroblasty odolaly. Oxidace mitochondriální sondy opět nastala jako první. Podrobnosti uvádí studie mitochondriální peroxidace lipidů při ferroptóze ve fibroblastech.

Co methylenová modř v těchto experimentech změnila

Methylenová modř je redoxní přenašeč. Její oxidovaná forma přijímá elektrony z reakcí navázaných na NADH v komplexu I a její redukovaná forma je předává cytochromu c, který zásobuje elektrony komplex IV. Tím vzniká částečná obchvatná cesta kolem úseku řetězce, kde elektrony běžně unikají na kyslík za vzniku superoxidu. Čtenáři, kteří chtějí úplný přehled tohoto přenosu, by měli začít článkem o tom, jak methylenová modř přenáší elektrony v mitochondriích.

V plicních fibroblastech vystavených erastinu zachovala methylenová modř při koncentraci 250 nanomolů na litr životaschopnost v testu přežívání buněk, stejně jako mitochondriálně cílené antioxidanty SkQ1 a MitoTEMPO. Kontrolní experimenty vymezují, co lze z výsledku vyvodit. Ochranný účinek měly také ferrostatin-1, alfa-tokoferol a deferoxamin, což potvrzuje, že smrt byla ferroptotická. Analog SkQ1 bez antioxidační skupiny ochranu neposkytoval, což ukazuje na redoxní chemii, nikoli na nespecifickou akumulaci. Při koncentracích SkQ1 nad přibližně 200 nanomolů na litr ochrana slábla, což odpovídá známému prooxidačnímu chování chinonových antioxidantů při vyšším množství. Methylenová modř vykazuje stejný dvojí účinek v závislosti na koncentraci: v těchto kultivačních miskách chrání při nízkých nanomolárních koncentracích, ale při vyšších koncentracích nebo silném osvětlení může redoxním cyklováním vytvářet peroxid vodíku. Tento typ kontextu závislosti na dávce rozebírá článek o reaktivních formách kyslíku v mitochondriích.

Experimenty s izolovanými mitochondriemi pak odlišily zdroje ROS. Za přítomnosti dvojmocného železa stimulovaly oxidaci sondy substráty dodávající elektrony komplexu I v kombinaci s rotenonem. Rotenon blokuje přenos za flavinovým místem, takže přenašeče před tímto místem zůstávají redukované a elektrony unikají na kyslík z flavinu obráceného do matrix. Substráty dodávající elektrony komplexu III v kombinaci s antimycinem A vytvářely velké množství peroxidu vodíku, ale nevyvolávaly peroxidaci lipidů. Stejný celkový signál ROS, jiné místo, jiný výsledek. SkQ1 i methylenová modř potlačovaly peroxidaci vyvolanou komplexem I, aniž by potlačovaly samotnou tvorbu peroxidu vodíku. To umisťuje jejich působení až za vznik ROS, do kroku peroxidace lipidů.

Větev s přetížením železem a vodítko v podobě lipofuscinu

Druhá studie zkoumala otázku ze strany železa. U kardiomyocytů H9c2 vystavených submilimolárním koncentracím citronanu železito-amonného vznikaly mitochondriální ROS, následovala peroxidace mitochondriálních lipidů a poté ferroptóza, po níž se během 24 hodin hromadil pigment podobný lipofuscinu. Lipofuscin je autofluorescenční zbytek oxidovaných lipidů a proteinů obsahující železo, který se hromadí s věkem. Jeho rychlý vznik zde propojuje akutní peroxidaci vyvolanou železem s klasickým markerem stárnutí. Methylenová modř v nanomolárních koncentracích i SkQ1 zabránily peroxidaci, buněčné smrti i hromadění pigmentu. Izolované srdeční mitochondrie tento průběh potvrdily: rotenon v kombinaci s dvojmocným železem vyvolával peroxidaci a signál podobný pigmentu a obě látky je blokovaly. Celou posloupnost popisuje studie přetížení železem v kardiomyocytech H9c2. Pigmentová část tohoto příběhu souvisí s tématem lipofuscinu a markerů buněčného stárnutí.

Co testy přežívání buněk neukazují

Test životaschopnosti, například CellTiterBlue, ukazuje, kolik buněk v kultivační misce zůstává metabolicky aktivních po působení spouštěče spolu s potenciálně ochrannou látkou. Jde o zkoušku mechanismu v definovaném systému. Nejde o výsledek léčby. V žádném z těchto experimentů nebyla látka podána pacientovi, nebyl měřen ukazatel onemocnění ani nebylo stanoveno terapeutické rozmezí v organismu.

Čtyři omezení je třeba uvést výslovně. Zaprvé je výběr buněčných typů úzký: transformované plicní fibroblasty, primární kožní fibroblasty včetně jedné linie s mitochondriálním onemocněním a linie potkaních kardiomyocytů, dále izolované mitochondrie z potkaního srdce. Citlivost se mezi liniemi lišila a linie LHON byla záměrně vybrána pro svou mimořádnou zranitelnost. Zadruhé jsou spouštěče laboratorními extrémy: úplná blokáda transportu nebo syntézy a zátěž železem, které by žádná tkáň nebyla akutně vystavena. Zatřetí koncentraci nelze převést pouhým násobením. Nanomolární koncentrace v kultivačním médiu není dávkou pro člověka. Mezi kultivační miskou a člověkem stojí distribuce methylenové modři, její redukce na bezbarvou formu v krvi a tkáních, expozice světlu i membránový potenciál. Začtvrté sondy podávají informace o svém vlastním kompartmentu. Oxidace MitoCLox ukazuje, že vznikly mitochondriální lipidové radikály; neukazuje, zda bylo prasknutí plazmatické membrány, pravděpodobná konečná událost, zabráněno přímo, nebo zda se mu předešlo zásahem v dřívějším kroku.

Poctivé tvrzení tedy zní takto: v těchto modelech ROS pocházející z komplexu I společně se železem vyvolávají peroxidaci mitochondriálních lipidů, která předchází ferroptóze, a methylenová modř v nízkých koncentracích tento úsek přerušuje. Vše, co přesahuje tento úsek, vyžaduje jiné experimenty na zvířatech a následně na lidech.