Alternativy k methylenové modři pro mikroskopii

U jednoduchého bakteriálního nátěru může krystalová violeť nahradit methylenovou modř, pokud je cílem pozorovat tvar buněk. U živých buněk může být lepší alternativou fázový kontrast zcela bez barvení. Volba závisí na tom, jaké pozorování potřebujete provést.

Představte si, že dva lidé zkoumají stejnou bakteriální kulturu. Jeden chce rozlišit tyčinkovité buňky od kulovitých. Druhý chce zjistit, zda ošetření bakterie usmrtilo. Barvivo, které prvnímu poskytne jasný obraz, nemusí druhému dát žádnou použitelnou odpověď.

Než zvolíte náhradu, dokončete tuto větu: „Potřebuji pozorovat ___ v ___ a buňky musí / nemusí zůstat živé.“ Tato věta určuje úkol, který musí barvicí metoda splnit.

Začněte vzorkem a otázkou

Nejprve rozhodněte, zda musí buňky zůstat živé, a poté určete znak, který potřebujete pozorovat:

Buňky musí zůstat živé: pro pohyb nebo tvar zvažte nebarvený fázový kontrast nebo DIC; pro jadernou DNA zvažte Hoechst 33342 s fluorescencí; pro integritu membrány zvolte validovanou metodu, například SYTO 9 s propidium iodidem.
Buňky nemusí zůstat živé: pro bakteriální morfologii zvažte jednoduché barvení krystalovou violetí nebo negativní barvení nigrosinem; pro Gramovu reakci použijte kompletní metodu Gramova barvení; pro jadernou DNA ve fixovaných buňkách zvažte fluorescenci DAPI. Pomocí této tabulky porovnejte omezení jednotlivých možností. Jde o volbu metod, nikoli o pokyny k výměně lahviček v rámci stávajícího protokolu.

Co potřebujete pozorovat	Vzorek a vybavení	Možná alternativa	Hlavní omezení
Tvar a uspořádání bakterií	Připravený bakteriální nátěr; světlé pole	Jednoduché barvení krystalovou violetí	Zobrazuje morfologii; neurčuje Gramovu reakci ani životaschopnost.
Obrysy buněk na tmavém pozadí	Bakteriologický preparát; světlé pole	Negativní barvení nigrosinem	Záleží na přípravě a složení; neobarvená buňka nemusí být živá.
Gramova reakce	Připravený bakteriální nátěr; světlé pole	Kompletní metoda Gramova barvení	Vyžaduje úplnou sekvenci činidel a kontroly.
Pohyb nebo změny v živých buňkách	Kompatibilní mokrý preparát; fázový kontrast nebo DIC	Bez barvení	Vyžaduje vhodnou optiku; kontrast neurčuje konkrétní molekulu.
Jaderná DNA	Fixované buňky; fluorescence	DAPI	Vyžaduje kompatibilní excitační a emisní filtry.
Jaderná DNA v živých buňkách	Živé buňky; fluorescence	Hoechst 33342	Průnik do buněk neprokazuje, že jsou zobrazovací podmínky neškodné.
Integrita bakteriální membrány	Nefixované bakterie; fluorescence	SYTO 9 s propidium iodidem	Barvení membrány je nepřímým měřítkem životaschopnosti.

U jednoduchého nátěru nahrazujte metodu obezřetně

Krystalová violeť je praktickou možností, pokud je úkolem získat jednobarevný obraz bakteriální morfologie. Bacteriological Analytical Manual americké FDA uvádí dvě formulace krystalové violeti vhodné pro jednoduché barvení. Použijte zdokumentovanou formulaci a příslušnou metodu přípravy; samotný název barviva neurčuje složení pracovního činidla.

Krystalová violeť se používá také při Gramově barvení, to však neznamená, že jednoduché barvení krystalovou violetí je Gramovo barvení. V protokolu ASM pro Gramovo barvení závisí diferenciální výsledek na postupném působení krystalové violeti, jódu, odbarvení a kontrastního dobarvení. Vynechání těchto kroků mění to, co lze z obrazu určit. Toto rozlišení je podrobněji vysvětleno v článku jednoduché barvení versus Gramovo barvení.

Nigrosin umožňuje zvýraznit obrysy jiným způsobem: ztmaví pozadí, zatímco bakteriální buňky zůstávají poměrně světlé. Pokyny společnosti Merck pro nigrosin obsahují důležitý detail, který může obecný seznam náhrad přehlédnout. Uvedená pracovní formulace obsahuje formaldehyd. Z označení „negativní barvení“ proto nelze vyvozovat kompatibilitu s živými buňkami, přestože samotné buňky vypadají neobarveně. Ověřte kompletní složení a způsob přípravy vzorku.

U živých vzorků zvažte změnu optiky

Pokud chcete sledovat pohyb nebo dělení buněk, zavedení dalšího barviva může pozorování komplikovat. Jak vysvětluje Nikon ve svém průvodci kontrastem u průhledných vzorků, fázový kontrast a diferenciální interferenční kontrast neboli DIC zviditelňují vzorky prostřednictvím rozdílů v jejich optických vlastnostech. Mohou zobrazit živé, neobarvené buňky, pokud má mikroskop potřebné komponenty.

Tato volba zachovává preparát neobarvený, ale mění dostupné informace. Můžete sledovat hranici nebo pohyb, aniž byste věděli, která molekula kontrast vytvořila. Pokud je cílem lokalizace molekuly, zvolte místo toho vhodnou značicí metodu.

Pro jadernou DNA rozlišuje společnost Invitrogen ve srovnání barviv DAPI a Hoechst běžné použití DAPI u fixovaných buněk od Hoechst 33342, který snadněji proniká do buněk a je preferován pro značení živých buněk. Obě metody vyžadují fluorescenční vybavení. Ani jedna není přímou náhradou barevného barvení pro mikroskopii ve světlém poli.

Expozici barvivu a osvětlení považujte za experimentální podmínky. Pokud měříte chování buněk, porovnávejte obarvené a neobarvené preparáty.

Červená buňka nemusí být automaticky mrtvá buňka

SYTO 9 a propidium iodid se často používají společně k hodnocení integrity bakteriální membrány. Příručka BacLight spojuje neporušené membrány se zeleným zbarvením a poškozené membrány s červeným zbarvením. Tuto interpretaci je nutné pro daný vzorek validovat.

Problém ilustruje studie Rosenberga a kolegů z roku 2019. Ve 24hodinových biofilmech E. coli na skle ve fosfátově pufrovaném fyziologickém roztoku se přibližně 96 % buněk in situ jevilo jako pozitivních na propidium iodid. Autoři však odhadli, že po odebrání bylo 82 % buněk kultivovatelných. Konfokální snímky ukázaly buňky se zeleným vnitřkem pod červeně obarveným materiálem, což poukazovalo na extracelulární nukleové kyseliny jako zdroj zavádějícího signálu.

Tato procenta popisují různé typy měření na preparátech z dané studie, nikoli univerzální korekční faktor. Podstatné je ověřit, co signál vytvořilo. V biofilmu může barvivo nukleových kyselin detekovat materiál mimo buňky stejně jako materiál uvnitř poškozených buněk. Pro závěr o životaschopnosti výzkumníci doporučují doplňková měření, například kultivaci nebo metabolickou aktivitu, přičemž upozorňují, že každá metoda má svá omezení.

Ověřte, co alternativa skutečně obsahuje

Alternativní barvicí metoda může stále obsahovat methylenovou modř. Příkladem je Giemsa: společnost Merck popisuje svůj produkt jako roztok azur-eosin-methylenové modři, určený mimo jiné pro krevní nátěry a nátěry kostní dřeně. Může jít o jinou metodu pro jiný vzorek, ale nesplňuje požadavek na vyloučení methylenové modři.

Pokud je vyloučení určité sloučeniny součástí experimentu, před porovnáváním snímků ověřte identitu a složení činidla. Průvodce methylovou modří, methylenovou modří a podobně pojmenovanými barvivy vysvětluje rozdíly v názvosloví.

Před použitím výsledku ověřte náhradu

U nové metody proveďte malé srovnání s reprezentativními vzorky a vhodnou kontrolou. Pokud je to možné, zachovejte srovnatelné nastavení mikroskopu. Zaznamenejte složení činidla, přípravu vzorku, expozici a podmínky zobrazování, aby bylo možné lépe vypadající snímek analyzovat, nikoli mu pouze dát přednost.

Úspěšnost posuzujte podle původní otázky. U morfologie zhodnoťte, zda zůstávají hranice buněk a jejich uspořádání interpretovatelné. U značení jader zhodnoťte umístění signálu a pozadí. U životaschopnosti vyžadujte důkazy nad rámec vizuálně přesvědčivého oddělení barev. Širší průvodce barvením methylenovou modří a laboratorními aplikacemi vysvětluje, jak spolu souvisejí pozorování a příprava vzorku.

Zvolte alternativu, která zachová měření, které potřebujete. Barva je pouze jednou z vlastností výsledného obrazu.