Article
Tinció simple amb blau de metilè i tinció de Gram: què pot demostrar cada mètode
Un estudiant prepara un frotis a partir d'un cultiu etiquetat com a E. coli, el cobreix amb blau de metilè durant un minut, l'esbandeix i l'observa amb l'objectiu d'immersió en oli. Uns bacils blaus omplen el camp. L'informe de laboratori diu: «Bacils gramnegatius identificats com a E. coli.» L'observació és correcta. La preparació, però, no justifica aquesta conclusió.
L'error és conceptual, no tècnic. L'estudiant ha tractat una tinció simple com si fos una prova diferencial. Una tinció simple i una tinció de Gram responen a preguntes diferents perquè es basen en conceptes de tinció diferents. Una pregunta és: quina forma hi ha. L'altra és: com es comporta la paret cel·lular quan se sotmet a una prova. Si es confonen les dues, una preparació tenyida correctament dona lloc a un informe injustificat.
Aquesta comparació manté els dos mètodes separats, mostra què permet afirmar cada resultat i respon a les dues preguntes que els estudiants fan més sovint: si el blau de metilè es pot utilitzar en la tinció de Gram i què mostra realment una tinció d'E. coli amb blau de metilè.
La resposta breu
La tinció simple amb blau de metilè tenyeix totes les cèl·lules tenyibles del mateix blau, de manera que revela la morfologia (bacils, esferes, espirals) i la disposició (cèl·lules aïllades, parelles, cadenes), però no aporta cap informació sobre la categoria de Gram. La tinció de Gram afegeix iode, una etapa de decoloració i un colorant de contrast, de manera que separa els bacteris en grampositius (violetes) i gramnegatius (roses o vermells) segons com les seves envoltes retenen el colorant. Uns bacils blaus després d'aplicar blau de metilè volen dir que «hi ha cèl·lules en forma de bastonet». Uns bacils roses després d'una seqüència completa de Gram volen dir que «hi ha bacils gramnegatius». La segona afirmació té més força perquè el procediment ha fet una prova addicional.
Per conèixer la família més àmplia de mètodes bacterians amb un sol colorant a la qual pertany aquest article, consulteu l'atles de tincions per a microscòpia.
Tinció simple: un colorant, una pregunta
El blau de metilè és un colorant bàsic (catiònic). El seu ió acolorit té càrrega positiva i s'uneix a estructures cel·lulars amb càrrega negativa, inclosos els àcids nucleics i els grups àcids de la superfície, de manera que les cèl·lules es veuen blaves sobre un fons pàl·lid. OpenStax descriu aquest principi de tinció positiva en el seu capítol sobre tincions. El catió del colorant és el petit ió pla de fenotiazina que es descriu detalladament a la referència sobre la química del blau de metilè; el contraió clorur no és el responsable de la coloració.
Un protocol docent estàndard és deliberadament senzill: feu un frotis prim, deixeu-lo assecar a l'aire, fixeu-lo amb calor, cobriu-lo amb una solució aquosa de blau de metilè d'aproximadament l'1% durant prop d'un minut, esbandiu-lo suaument amb aigua, assequeu-lo per contacte amb paper absorbent i examineu-lo amb immersió en oli. Un protocol docent de LibreTexts presenta exactament aquesta pauta de l'1% durant un minut, tot indicant que alguns laboratoris allarguen el temps. Sense mordent, sense decolorant, sense un segon colorant. Aquesta absència és precisament la clau. Amb un únic colorant i sense eliminació selectiva, totes les cèl·lules que fixen el colorant acaben del mateix color.
Amb E. coli, el camp esperat és de bacils blaus, aïllats, en parelles o en petits grups. El blau prové del colorant. La forma de bastonet prové de l'organisme. Però aquesta combinació no identifica l'organisme, perquè moltes espècies tenen forma de bacil i molts bacils es tenyeixen de blau en una tinció simple. ATCC explicita aquest límit, restringit a la morfologia, en la seva guia de cultius microbiològics. Un informe correcte diu: «S'observen bacils blaus.» Qualsevol afirmació que vagi més enllà de la forma i la disposició necessita més proves.
Tinció de Gram: quatre reactius, una prova de comportament
La tinció de Gram és una tinció diferencial. Sotmet totes les cèl·lules a la mateixa seqüència i permet observar quines retenen el primer colorant i quines el perden. Els protocols de tinció de Gram de l'American Society for Microbiology defineixen l'ordre estàndard de quatre passos: cristall violeta (colorant primari), iode de Gram (mordent), alcohol o alcohol-acetona (decolorant) i, finalment, safranina (colorant de contrast).
| Pas | Reactiu | Funció | Resultat grampositiu | Resultat gramnegatiu |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Cristall violeta | Colorant primari, tenyeix totes les cèl·lules de violeta | Violeta | Violeta |
| 2 | Iode de Gram | Mordent, forma un complex amb el cristall violeta | Violeta | Violeta |
| 3 | Decolorant | Elimina selectivament el complex | Es manté violeta | Esdevé incolor |
| 4 | Safranina | Colorant de contrast, tenyeix les cèl·lules decolorades | Es manté violeta | Rosa o vermell |
El model docent estàndard explica aquesta separació a partir de l'estructura de l'envolta. Les cèl·lules grampositives tenen una paret gruixuda de peptidoglicà que es deshidrata i reté el complex de cristall violeta i iode durant el rentat amb alcohol. Les cèl·lules gramnegatives tenen una capa prima de peptidoglicà i una membrana externa rica en lípids que el decolorant desorganitza; per això, el complex s'elimina amb el rentat i les cèl·lules capten després la safranina. La revisió sobre la tinció de Gram de NCBI Bookshelf ofereix aquesta explicació basada en la paret cel·lular. Els especialistes afegeixen que el conjunt dels processos fisicoquímics és més complex que el gruix de la paret per si sol, però, per a la interpretació al laboratori, la regla de comportament es manté: el violeta indica retenció; el rosa, pèrdua del colorant inicial seguida de tinció de contrast.
Panells il·lustratius. Dibuixos estilitzats per comparar mètodes, no micrografies captades amb una càmera. Els colors s'han simplificat per ensenyar-ne la lògica: un color en una tinció simple, dos colors després de la decoloració de Gram.
Es pot utilitzar el blau de metilè en la tinció de Gram
Aquesta pregunta té dues interpretacions, i cadascuna necessita una resposta diferent.
Primera interpretació: si una única aplicació de blau de metilè pot substituir tota la seqüència de Gram. No. Sense iode, decolorant i colorant de contrast no hi ha cap etapa diferencial i, per tant, no es comprova cap categoria de Gram. Un camp blau després d'aplicar només blau de metilè és el resultat d'una tinció simple, encara que l'ampolla sigui al costat dels reactius de Gram. No el registreu com un resultat de Gram.
Segona interpretació: si el blau de metilè pot substituir la safranina com a colorant de contrast al pas 4. Funcionalment, pot tenyir les cèl·lules decolorades, i un exercici de llibre de text prediu cèl·lules grampositives violetes i cèl·lules gramnegatives blaves després d'aquesta substitució. La lògica és sòlida perquè les cèl·lules gramnegatives decolorades correctament són gairebé incolores i captaran un altre colorant catiònic. Però no és el protocol estàndard. Els protocols de l'ASM especifiquen la safranina, amb alternatives reconegudes com la fucsina bàsica en algunes variants, però no el blau de metilè. També hi ha un inconvenient pràctic: és més difícil distingir el blau del violeta que el rosa del violeta, especialment per als principiants i amb làmpades de microscopi desgastades. Per a les pràctiques docents i per a qualsevol resultat que tingui importància, utilitzeu el colorant de contrast indicat al vostre protocol, habitualment la safranina, i tracteu la tinció de contrast amb blau de metilè com una variant de demostració, no com un estàndard equivalent.
La qüestió relacionada de com es compara el blau de metilè amb altres opcions d'un sol colorant es tracta en una comparació de tincions bacterianes simples.
Què demostra una tinció d'E. coli amb blau de metilè i què no demostra
E. coli és un bacil gramnegatiu, però aquesta frase combina dades obtingudes amb diversos mètodes: la morfologia prové de la microscòpia; la reacció de Gram, d'una tinció de Gram; i la identitat, del cultiu combinat amb proves bioquímiques o moleculars. Un frotis amb blau de metilè només aporta la primera part. Estableix que hi ha cèl·lules en forma de bastonet a la mostra tenyida i com estan disposades. No estableix la reacció de Gram, perquè no s'ha fet cap prova de decoloració. No identifica l'espècie, perquè els bacils de moltes espècies s'assemblen a aquesta resolució.
És aquí on els informes fallen d'una manera previsible. Qui redacta incorpora coneixements previs («se suposa que aquest cultiu és d'E. coli, i E. coli és gramnegatiu») a la línia d'observació, de manera que la preparació sembla confirmar allò que en realitat s'ha donat per fet. Un informe més clar separa els nivells: «Tinció simple amb blau de metilè: s'observen bacils blaus; només morfologia, sense comprovar cap categoria de Gram.» Després, si s'ha fet correctament una tinció de Gram amb controls: «Tinció de Gram: bacils roses, compatibles amb gramnegatius.» La identitat de l'espècie arriba més endavant, a partir del procés d'identificació, no només del color.
Una guia pràctica d'interpretació
Apliqueu aquesta regla de decisió al laboratori. Si totes les cèl·lules són d'un sol color i el protocol ha utilitzat un únic colorant sense decolorant, heu fet una tinció simple. Informeu de la forma, la mida estimada i la disposició. No aneu més enllà. Si el protocol ha utilitzat cristall violeta, iode, decolorant i colorant de contrast amb controls positius i negatius coneguts, heu fet una tinció de Gram. Informeu del color i de la morfologia: cocs violetes en cadenes, bacils roses, etc.
Tres errors expliquen la major part de la confusió. Primer, interpretar excessivament els bacils blaus com una confirmació d'E. coli. Segon, registrar una preparació amb blau de metilè sota l'encapçalament «Tinció de Gram» al quadern, cosa que els lectors posteriors interpretaran malament. Tercer, substituir els colorants de contrast sense prou criteri i després comparar colors entre laboratoris com si les paletes coincidissin. Tots tres errors tenen la mateixa solució: anomeneu el mètode que s'ha fet realment i afirmeu només allò que aquest mètode comprova.
La tinció simple té el seu lloc precisament perquè permet afirmar ben poca cosa. És ràpida, tolera petites desviacions i és suficient quan la pregunta és morfològica: si hi ha alguna cosa i quina forma té. Quan la pregunta és de classificació, feu la prova diferencial. La preparació blava us diu quin aspecte tenen les cèl·lules. La preparació violeta o rosa us diu com es comporten les seves parets. Cap de les dues, per si sola, us diu quina és l'espècie.