Tinció de cèl·lules bucals amb blau de metilè: què cal observar

Una alumna posa una gota de suspensió de cèl·lules bucals en un portaobjectes, mira pel microscopi i no hi veu gairebé res. Unes quantes ombres pàl·lides suren sobre un camp lluminós. Ajusta l’enfocament, augmenta la llum i acaba concloent que el portaobjectes és buit. Però no ho és. Les cèl·lules hi són. Són gairebé transparents, i aquesta transparència és precisament el problema que aquesta tinció pretén resoldre.

Convé fer explícita aquesta discrepància entre les expectatives i la imatge abans de començar el protocol. Els principiants esperen que un microscopi reveli detalls com el zoom d’una càmera permet llegir un rètol llunyà. Un microscopi de camp clar fa una cosa més limitada: mostra diferències en l’absorció de la llum. Una cèl·lula bucal sense tenyir no absorbeix gairebé gens de llum i, per tant, gairebé no aporta cap diferència. El blau de metilè hi afegeix aquesta diferència. S’uneix de manera desigual a l’interior de la cèl·lula i converteix l’estructura en contrast. Quan l’alumnat entén aquest concepte, cada pas posterior es veu com una conseqüència i no com una recepta.

Aquí ajuda conèixer com les tincions simples aporten contrast al laboratori escolar, i repassar la preparació d’un microscopi de camp clar abans de tenyir evita la meitat de les preparacions fallides. La química que explica el color es tracta en una introducció al blau de metilè en microscòpia, que explica per què aquest colorant continua sent tan habitual a la taula de laboratori.

El protocol per a l’aula

La versió de muntatge en fresc que es presenta a continuació és l’opció més senzilla per a les classes generals. No necessita flama ni cap pas de fixació. La variant de frotis fixat que fan servir alguns manuals universitaris afegeix un assecat a l’aire i una breu fixació per calor, com en l’activitat de frotis bucal del North Central Texas College publicada a Biology LibreTexts, però la fixació per calor és una pràctica habitual en microbiologia, no un requisit per veure cèl·lules epitelials.

Material necessari: portaobjectes i cobreobjectes nets, hisops estèrils d’un sol ús (preferibles) o escuradents plans nous, un flascó comptagotes de blau de metilè aquós al 0.5 a 1 per cent, aigua destil·lada o desionitzada, paper secant, guants i un microscopi compost amb augments totals de 100x i 400x.

1. Esbandiu-vos la boca amb aigua sola. Això elimina les partícules d’aliments que després es tenyeixen intensament i distreuen l’atenció de les cèl·lules.
2. Cada alumne només pren una mostra de la seva pròpia galta. Fregueu suaument l’interior de la galta amb un hisop estèril nou. Pressioneu, no rasqueu. Atureu-vos molt abans que aparegui cap molèstia o sagnat.
3. Feu rodolar l’hisop pel centre d’un portaobjectes net per formar una capa fina. Una pel·lícula fina és el factor que millor prediu si la preparació es podrà interpretar. Un dipòsit blanc gruixut es tenyirà i es convertirà en una massa blava impossible d’interpretar.
4. Afegiu una gota de blau de metilè sobre el frotis. Deixeu-la actuar d’1 a 3 minuts. Un minut és suficient en molts protocols universitaris; el manual de laboratori de ciències de la classe IX del NCERT fa servir uns 3 minuts per a un muntatge temporal. Més temps no és millor, i tenyir en excés és l’error de temporització més habitual.
5. Esbandiu suaument amb aigua destil·lada o absorbiu l’excés de colorant amb paper secant, seguint el protocol local. El fons ha de quedar blau pàl·lid, no blau marí intens.
6. Abaixeu el cobreobjectes inclinat perquè primer hi toqui una vora i després deixeu-lo caure lentament. Això evita les bombolles d’aire.
7. Comenceu amb pocs augments per trobar les cèl·lules, confirmeu l’enfocament i el centrat i després passeu a 100x i, finalment, a 400x. A 400x feu servir només l’ajust fi de l’enfocament.

La concentració del colorant mereix una frase de precisió. Els protocols escolars solen fer servir blau de metilè aquós al voltant de l’1 per cent. Una solució mare més concentrada o una exposició llarga enfosqueix el fons més de pressa que el nucli, cosa que inverteix el contrast del qual depèn l’exercici.

Manipulació segura del material bucal

Les mostres bucals contenen saliva i microorganismes normals de la boca; per tant, tracteu cada frotis fresc com a material potencialment infecciós, encara que els donants siguin companys de classe sans. Les directrius de bioseguretat per als laboratoris docents de l’American Society for Microbiology estableixen els principis generals: avaluar el risc abans de la sessió, portar guants, protegir els ulls quan hi pugui haver esquitxades, rentar-se les mans després, desinfectar les taules de laboratori i eliminar el material d’un sol ús contaminat pel circuit autoritzat de residus biològics.

Quatre normes d’aula cobreixen la major part del risc. Un únic donant per hisop i per portaobjectes, sense compartir-los mai. Només es poden prendre mostres pròpies, mai d’un company. Els hisops i els escuradents d’un sol ús han d’anar directament al contenidor de residus designat, mai tornar a la taula. El mateix blau de metilè taca la pell i la roba i irrita els ulls, de manera que cal portar guants i aplicar les mesures habituals d’higiene en manipular colorants. No amplieu aquest exercici cultivant cap material del frotis, ni improviseu la fixació per calor de material humà fresc fora del procediment de seguretat del centre.

Què cal observar i per què té aquest aspecte

A 100x, busqueu cèl·lules amples i planes, de color blau pàl·lid, amb contorns ovalats irregulars o poligonals. Es troben aïllades o en làmines poc compactes que se superposen. Cada cèl·lula acostuma a tenir una taca blava més fosca. Aquesta taca és el nucli. Fixeu-vos també en la disposició: les cèl·lules epitelials escatoses són com rajoles fines, no esferes, i per això les vores recorden un esmalt esquerdat més que no pas globus rodons.

A 400x, es distingeixen clarament tres característiques. El límit cel·lular apareix com una línia fina més fosca que envolta la cèl·lula. El citoplasma omple l’interior d’un blau clar uniforme. El nucli és més fosc i compacte, sovint ovalat, i acostuma a estar prop del centre, però no sempre. Demaneu a l’alumnat que anoti totes tres característiques, així com la forma i els augments, perquè això és exactament el que demana la fitxa.

Aquí hi ha un punt de precisió important que moltes fitxes expliquen malament. El límit visible correspon a la regió de la membrana plasmàtica, però la membrana mateixa, una bicapa lipídica d’aproximadament 7 a 10 nanòmetres de gruix, és molt per sota del que un microscopi escolar pot resoldre. El que veu l’alumnat és la vora òptica de la cèl·lula més el colorant que s’hi ha acumulat. La mateixa precaució s’aplica als orgànuls. En aquesta preparació no es veuen els mitocondris, el reticle endoplasmàtic, els aparells de Golgi ni els ribosomes. Un microscopi òptic convencional pot resoldre detalls de fins a aproximadament 0.2 micròmetres en bones condicions, tal com explica la introducció de biologia cel·lular de l’NCBI a les eines de microscòpia, i la major part de la ultraestructura es troba per sota d’aquest límit o a prop. Un augment buit més gran fa la imatge més grossa sense afegir-hi detall.

Per què el nucli es tenyeix més fosc? El blau de metilè és un colorant catiònic, amb càrrega positiva en solució, i s’associa amb material de càrrega negativa de la cèl·lula, sobretot amb els àcids nucleics. La cromatina concentra l’ADN al nucli, de manera que el nucli acumula més colorant. El citoplasma conté ARN i altres molècules amb càrrega, de manera que també es tenyeix, però de manera més difusa i més clara. El matís essencial: el blau de metilè no és un colorant específic de l’ADN. Els estudis sobre la distribució del blau de metilè en la imatgeria nuclear descriuen l’associació del catió amb regions riques en àcids nucleics, i treballs quantitatius anteriors sobre la unió del blau de metilè en preparacions cel·lulars van trobar que la major part del colorant unit estava associat amb àcids nucleics. Per tant, un nucli fosc i un citoplasma clar constitueixen un patró de contrast, no un assaig molecular.

Errors que cometrà l’alumnat i com interpretar-los

Gairebé totes les preparacions fallides encaixen en un de cinc patrons. Ensenyeu a l’alumnat a identificar el problema de la preparació en lloc de repetir-la a cegues.

La tinció excessiva enfosqueix uniformement les cèl·lules i el fons, de manera que el nucli es confon amb el camp. Corregiu-ho amb un temps de tinció més curt o una esbandida més completa. La tinció insuficient deixa ombres que desapareixen quan s’augmenta la llum; allargueu el temps en intervals de trenta segons. Els frotis gruixuts produeixen masses denses superposades en què no es pot resseguir cap contorn; la correcció és mecànica: la pròxima vegada esteneu una capa més fina, perquè cap esbandida pot salvar un munt de cèl·lules. Les bombolles d’aire apareixen com cercles perfectes amb vores fosques ben definides i distreuen els principiants, que les confonen amb estructures; torneu a col·locar el cobreobjectes lentament i inclinat. Els petits punts foscos escampats sobre les cèl·lules o al seu voltant solen ser bacteris normals de la boca, tal com indiquen protocols escolars com el procediment de cèl·lules bucals d’Ingrid Science. Confirmen que la boca està habitada, un fet que pot quedar gravat en la memòria de l’alumnat, però en aquest exercici no se’n pot identificar l’espècie i no s’han de dibuixar com a parts de la cèl·lula. Les restes d’aliments i els filaments de moc es tenyeixen de manera irregular i intensa; l’esbandida prèvia serveix per reduir-los.

Què no pot fer aquest exercici

Aquesta és una observació educativa, no una prova diagnòstica. Cap aspecte de les cèl·lules en una tinció feta a l’aula permet diagnosticar una infecció, un càncer o cap altra malaltia, i l’article no s’ha d’interpretar com si suggerís el contrari. La preparació mostra la forma, el límit, el citoplasma i el nucli a dos augments. No mostra la ultraestructura de la membrana, el detall dels orgànuls ni la identitat molecular. Explicitar aquest límit protegeix tant la ciència com l’alumnat: un bon resultat és un dibuix correctament anotat amb els augments i la tinció registrats, no una conclusió sobre la salut.

Fitxa per a l’alumnat i micrografies anotades

Els dos recursos del projecte per a aquesta pàgina són la micrografia anotada anterior i la fitxa següent. Imprimiu una fitxa per alumne o projecteu-la i demaneu a l’alumnat que copiï els requadres als quaderns.

Com fer-la servir en una sessió de 45 minuts: deu minuts per a les instruccions de seguretat i la presa de mostres, deu minuts per a la tinció i el muntatge, quinze minuts per a l’observació i el dibuix als dos augments, i deu minuts per a la llista de comprovació i la comparació amb la micrografia anotada. Els elements de la llista són deliberadament mecànics. Frotis fi, temps de tinció correcte, nucli més fosc que el citoplasma, augments registrats. Qui pot marcar tots quatre ha entès el concepte que aquesta lliçó pretén ensenyar: els microscopis mostren diferències, i les tincions creen les diferències que val la pena mostrar.