Mesurar els efectes mitocondrials del blau de metilè: oxigen, ATP i potencial de membrana

Suposem que un laboratori afegeix blau de metilè a mitocondris amb la respiració alterada i observa un augment del consum d'oxigen. La frase que semblaria natural escriure és que el colorant ha restablert la funció mitocondrial. Aquesta frase pot ser errònia. El flux d'oxigen, la síntesi d'ATP i el potencial de membrana són tres conceptes diferents. Comparteixen el mateix orgànul de la mateixa manera que les còpies de seguretat, la sincronització i la compartició comparteixen una mateixa carpeta al núvol: estan relacionats, però es regeixen per regles diferents. Confondre'ls fa fallar la interpretació, encara que totes les mesures siguin tècnicament correctes.

El blau de metilè afavoreix aquesta confusió perquè participa en el sistema que mesura. Participa en cicles redox en què accepta electrons en un punt de la cadena i els cedeix més endavant, és un catió lipòfil que s'acumula als mitocondris energitzats i és un compost d'un blau intens que absorbeix i emet llum a les mateixes bandes que les sondes habituals. Una sola lectura no pot donar compte de tot això. El patró fiable, mostrat al llarg dels estudis mitocondrials de Budapest, és mesurar el flux d'oxigen, la taxa de síntesi d'ATP, el potencial de membrana i l'alliberament de peròxid d'hidrogen, amb controls específics per al colorant en cada pas.

La respirometria mesura el flux d'oxigen, no la producció d'energia

La respirometria d'alta resolució, tant amb l'Oroboros Oxygraph com amb l'analitzador de flux extracel·lular Seahorse, informa d'una sola cosa: a quina velocitat es redueix l'oxigen. No informa de quants protons s'han bombat per electró, de quina part del gradient s'ha conservat ni de si l'ATP-sintasa l'ha utilitzat.

El vocabulari importa. En mitocondris aïllats, el substrat sense ADP dona la respiració de fuita, el substrat amb ADP en concentració saturant dona la capacitat de fosforilació oxidativa i la titulació amb un desacoblant dona la capacitat màxima de transferència d'electrons. En cèl·lules intactes, els equivalents de Seahorse són la respiració basal, la respiració lligada a l'ATP sensible a l'oligomicina, la fuita de protons, la respiració màxima definida amb FCCP i el consum d'oxigen no mitocondrial resistent a la rotenona i l'antimicina. Anomenar les lectures de Seahorse estat 3 i estat 4 els atribueix una precisió que la preparació no permet, tal com deixa clar el marc del Mito Stress Test d'Agilent.

El blau de metilè trenca el vincle intuïtiu entre més oxigen i més energia. En mitocondris aïllats de cervell de conillet d'Índies, entre 100 nM i 1 uM de colorant van augmentar el consum d'oxigen en repòs amb glutamat més malat, succinat i alfa-glicerofosfat com a substrats, amb un augment d'aproximadament el 64 per cent amb alfa-glicerofosfat; en canvi, la respiració estimulada per ADP en mitocondris sans es va mantenir pràcticament inalterada, segons l'estudi de mitocondris cerebrals aïllats. Com que la respiració de fuita va augmentar mentre el flux estimulat per ADP es mantenia estable, la relació de control respiratori calculada disminueix. Aquesta disminució no significa que el colorant hagi danyat els mitocondris. Significa que el colorant ha afegit un cicle redox que consumeix oxigen a la respiració normal. Un assaig de consum d'oxigen amb blau de metilè que només informa de l'augment ha mesurat una reacció química real, però no ha dit res sobre la conservació de l'energia.

Els experiments de recuperació mostren la mateixa discrepància a una escala més gran. Amb el complex I bloquejat, el flux d'oxigen es va recuperar aproximadament fins al triple, mentre que la síntesi d'ATP només es va recuperar fins a unes 1.5 vegades. Va arribar més oxigen a l'elèctrode. Una part menor d'aquest oxigen va contribuir a produir ATP. Qualsevol afirmació de millora de la fosforilació oxidativa necessita també les dades d'ATP, idealment expressades com una relació d'ATP per oxigen amb la convenció del denominador especificada.

Els assajos d'ATP mesuren la taxa de síntesi, que el contingut no pot substituir

Un assaig d'ATP respon a una pregunta diferent: quant ATP es genera per unitat de temps. Una lectura cinètica, ja sigui de la luminescència de la luciferasa de cuca de llum seguida durant minuts o d'un assaig acoblat d'hexocinasa més glucosa-6-fosfat-deshidrogenasa amb lectura a 340 nm, proporciona una taxa. Una única mesura final de l'ATP total proporciona el contingut, que reflecteix la síntesi menys el consum i que, per si sol, diu poca cosa sobre la fosforilació oxidativa.

El grup de Budapest va utilitzar el mètode enzimàtic acoblat amb l'adenilat-cinasa inhibida i va trobar que el blau de metilè a entre 1 i 2 uM augmentava de manera modesta però significativa la producció d'ATP en mitocondris tractats amb rotenona i amb antimicina. És una recuperació real, i és parcial. L'estudi de toxicitat del TEGDMA va arribar al mateix tipus de resultat en un model diferent: 5 mM del monòmer dental TEGDMA van fer caure la respiració lligada al complex I d'aproximadament 286 a 28 unitats de flux, i 2 uM de colorant la van restablir fins a aproximadament 86.

Amb un compost redox acolorit, hi ha dos controls imprescindibles. Primer, utilitzeu oligomicina per establir quina part de la síntesi d'ATP mesurada depèn de l'ATP-sintasa. Segon, feu una prova de recuperació d'una addició coneguda d'ATP en absència de cèl·lules, amb el reactiu complet i les concentracions exactes de colorant utilitzades, com a mínim 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM. El colorant pot absorbir la llum emesa, inhibir l'enzim indicador o alterar la química redox del reactiu, i les directrius generals per als assajos de luciferasa recomanen contraassajos bioquímics precisament per a aquesta classe d'interferència. No pressuposeu que 1 uM no genera artefactes només perquè l'extinció de la fluorescència acostuma a ser més intensa a concentracions més altes.

Les sondes de potencial de membrana mesuren la distribució del colorant, no el flux

La safranina O, el TMRM i el TMRE, la rodamina 123 i el JC-1 són tots cations permeables a la membrana. S'acumulen a la matriu carregada negativament segons l'equilibri electroquímic, de manera que la fluorescència global informa indirectament del potencial a través de la ubicació de la sonda. Cap d'aquestes sondes mesura l'ATP ni el flux d'electrons.

Cada sonda té una preparació preferent. La safranina O és adequada per a mitocondris aïllats i cèl·lules permeabilitzades, habitualment a prop de 2 uM, amb excitació a prop de 495 nm i emissió a prop de 585 nm, en un règim d'extinció en què la captació modifica la fluorescència global. El TMRM i el TMRE són adequats per a cèl·lules intactes amb una càrrega nanomolar baixa en un mode sense extinció, en què la despolarització allibera el colorant i la fluorescència mitocondrial disminueix; amb càrregues altes, la direcció del senyal es pot invertir per autoextinció. El JC-1 proporciona una relació pràctica entre el verd i el vermell, però depèn de la càrrega i de la massa mitocondrial, cosa que el fa menys adequat per al treball quantitatiu que el TMRM controlat amb cura. Aquests avantatges i limitacions es resumeixen en una revisió de les sondes de potencial de membrana mitocondrial àmpliament utilitzada.

El blau de metilè interfereix òpticament precisament a les concentracions de treball. Les seves bandes d'absorció a prop de 600 a 665 nm se superposen amb l'emissió vermella de les sondes, de manera que els efectes de filtre intern, l'extinció i l'absorció de la llum d'excitació són tots plausibles. El colorant també és un segon catió lipòfil, la distribució del qual canvia amb el potencial que es mesura. La defensa és combinar redundància i blancs: sonda sola, colorant sol, sonda amb cada concentració de colorant, despolarització completa amb FCCP com a referència de zero i, idealment, una segona sonda òpticament diferent. L'estudi de la via alternativa al complex III va establir aquest precedent repetint la recuperació del potencial de membrana tant amb safranina O com amb TMRM després de la inhibició amb antimicina i mixotiazol, i va obtenir la mateixa recuperació qualitativa. Un indicador òptic és un indici. Dos indicadors independents són evidència.

Tres preparacions, tres preguntes diferents

Els mitocondris aïllats, les cèl·lules permeabilitzades i les cèl·lules intactes no són ajustos de sensibilitat intercanviables d'un mateix assaig. Són conceptes diferents amb principis de funcionament diferents.

Els mitocondris aïllats conserven la cadena de transport d'electrons, la membrana interna i la maquinària de la matriu, mentre s'eliminen la membrana plasmàtica, el citosol i l'arquitectura de la xarxa. Aquesta eliminació és precisament l'objectiu: els substrats, l'ADP, els inhibidors i les concentracions de colorant es defineixen amb exactitud, de manera que es pot identificar una via. El cost és la pèrdua del subministrament natiu de substrats, de la senyalització i de la demanda.

Les cèl·lules permeabilitzades mantenen els mitocondris dins de bona part de la seva arquitectura cel·lular, alhora que deixen passar substrats exògens i ADP a través de la membrana plasmàtica oberta. Són l'eina adequada per atribuir un defecte a una via de substrat dins d'un context cel·lular. Una permeabilització excessiva danya la membrana externa, i la regulació citosòlica es perd amb el rentat.

Les cèl·lules intactes ho conserven tot: la barrera de la membrana plasmàtica, els reductors citosòlics, el transport endogen de substrats, la xarxa mitocondrial i la demanda d'ATP. Són les més properes a la fisiologia i les més allunyades del mecanisme, perquè la captació, la reducció i el segrest del colorant condicionen l'exposició mitocondrial efectiva.

L'estudi del TEGDMA va utilitzar deliberadament els tres nivells: mitocondris cerebrals aïllats per estudiar la recuperació de l'oxidació i del potencial amb el colorant, cèl·lules mare de la polpa dental permeabilitzades principalment per localitzar la lesió en l'oxidació de substrats lligada al complex I, i cèl·lules mare intactes per estudiar l'efecte fisiològic net de 2 uM de colorant sobre el consum d'oxigen inhibit. Per als lectors que comparen lectures mitocondrials entre preparacions, l'article complementari sobre com el blau de metilè mou electrons a través de la cadena respiratòria aporta el context de les vies, i la guia per interpretar estudis de respiració amb blau de metilè tracta la lògica de les dosis i dels inhibidors.

Controls que exigeix un colorant amb activitat redox

Un compost que participa en cicles redox necessita una llista de controls més llarga que un inhibidor ordinari, perquè la química del colorant sol pot imitar la biologia.

Per a la respirometria, utilitzeu una cambra només amb tampó per mesurar la deriva, una cambra amb tampó i colorant sense material biològic, el colorant amb qualsevol reductor extracel·lular present a l'assaig i, al final, rotenona més antimicina per definir el consum d'oxigen no mitocondrial en cèl·lules intactes. Tingueu en compte que el colorant reduït es reoxida transferint electrons a l'oxigen per formar peròxid d'hidrogen; per tant, un blanc només amb colorant i sense un donador d'electrons subestima el consum d'oxigen en absència de cèl·lules que apareix quan hi ha NADH o NADPH disponibles.

Per al peròxid d'hidrogen, preferiu Amplex UltraRed calibrat amb peroxidasa de rave picant als colorants DCFDA no selectius, verifiqueu els resultats amb catalasa i comproveu la dependència de la il·luminació, ja que el colorant és un fotosensibilitzador. L'estudi de mitocondris cerebrals va trobar que la càrrega de peròxid augmentava més de quatre vegades amb només 100 nM de colorant, mentre que l'eliminació s'alentia, i que el peròxid es formava directament a partir del colorant reduït sense un intermediari superòxid. Els detalls sobre l'elecció de la sonda i els controls de llum es tracten a l'article complementari sobre la mesura d'espècies reactives d'oxigen en experiments amb colorants, i la qüestió més àmplia de quan el peròxid actua com a senyal o com a càrrega es tracta juntament amb l'equilibri redox cel·lular i les afirmacions sobre antioxidants.

Per a les afirmacions sobre vies, comproveu tots dos llocs d'inhibició del complex III: antimicina A al lloc Qi i mixotiazol al lloc Qo, i afegiu una prova final del complex IV amb cianur. Un estudi anterior amb cervell de ratolí va informar de recuperació amb el colorant de la respiració bloquejada per rotenona, però no de la bloquejada per antimicina, mentre que l'estudi posterior amb tres espècies va trobar una recuperació parcial amb tots dos inhibidors i evidència de reducció directa del citocrom c. Considereu la via alternativa compatible amb les dades més recents, no pas definitivament establerta, ja que la concentració del colorant, el lloc d'inhibició, l'estat dels substrats i la distribució del colorant modifiquen la via observada.

Matriu de selecció d'assajos

Utilitzeu aquesta taula per triar la mesura a partir de la pregunta, i no a l'inrevés.

Perquè una afirmació sigui mínimament convincent, cal utilitzar les mateixes concentracions de colorant, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM, per mesurar el flux d'oxigen en condicions de fuita, amb ADP, amb oligomicina i amb desacoblant, la taxa de síntesi d'ATP, el potencial de membrana preferiblement amb dues sondes i l'alliberament calibrat de peròxid amb catalasa i controls sense cèl·lules. Informeu del conjunt de dades relacionades: flux d'oxigen, taxa d'ATP, ATP per oxigen, potencial i peròxid. Qualsevol d'aquestes xifres, tota sola, és una mesura que busca un significat.