Article
Nou blau de metilè i tinció de reticulòcits: un colorant diferent i un mètode amb cèl·lules vives
Un estudiant prepara un recompte de reticulòcits, demana blau de metilè, el barreja amb sang i gairebé no hi veu res. Un company fa servir un flascó etiquetat com a nou blau de metilè i obté filaments blaus nítids a l'interior d'una part dels eritròcits. El primer estudiant suposa que el segon flascó és més recent o més concentrat. No és ni una cosa ni l'altra. Conté una molècula diferent.
Aquest és l'error conceptual que explica bona part de la confusió en aquest àmbit. El nom suggereix que el nou blau de metilè és un lot millorat de blau de metilè. La química diu el contrari. El nou blau de metilè N és un colorant fenotiazínic diferent, amb un número propi del Colour Index, un patró de substitució propi i una funció estandarditzada pròpia en hematologia. Un cop clara aquesta distinció, la resta del mètode —per què les cèl·lules han d'estar vives quan es tenyeixen, què es considera un reticulòcit, quin paper hi tenen els cossos de Heinz i quan entra en joc el blau de cresil brillant— esdevé fàcil d'entendre.
La resposta breu
El nou blau de metilè N, el reactiu d'hematologia, s'identifica generalment com a Basic Blue 24 a la fitxa de PubChem del nou blau de metilè, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fórmula C18H22ClN3S. El blau de metilè ordinari és clorur de metiltionini, Basic Blue 9, a la seva fitxa de PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fórmula C16H18ClN3S. Estructuralment, el nou blau de metilè porta dos grups metil a l'anell i cadenes laterals etilamino allà on el blau de metilè porta grups dimetilamino. Aquesta diferència modifica el comportament de tinció. Els textos d'hematologia descriuen el blau de metilè ordinari com un colorant relativament deficient per als reticulòcits, i el nou blau de metilè com un colorant que produeix una tinció més intensa i uniforme, una comparació resumida a la pàgina temàtica de ScienceDirect sobre el nou blau de metilè.
Sí, el nou blau de metilè és un colorant supravital. La tinció supravital consisteix a tenyir cèl·lules vives després d'extreure-les del cos i abans de fixar-les, tal com es defineix a la revisió de l'NCBI sobre els principis de la tinció supravital. Tant el nou blau de metilè com el blau de cresil brillant pertanyen a aquesta categoria, i la norma del CLSI sobre reticulòcits inclou explícitament el nou blau de metilè com a colorant supravital. De vegades, els estudiants el classifiquen juntament amb la tinció de Romanowsky d'estesos fixats. Aquest esquema mental no funciona aquí. Si es fixa primer, el mètode deixa de funcionar.
Per als lectors que vulguin aclarir noms de colorants semblants, blau de metil en comparació amb blau de metilè tracta una confusió diferent i més àmplia entre un colorant aniònic de triarilmetà i la família catiònica de les fenotiazines. La visió general de les tincions de laboratori situa el treball supravital entre els mètodes amb estesos fixats, i la guia de morfologia de les cèl·lules sanguínies mostra on encaixa l'avaluació dels reticulòcits dins del recompte diferencial més ampli.
| Reactiu | Identitat | C.I. / CAS | Funció en l'estudi dels reticulòcits |
|---|---|---|---|
| Nou blau de metilè N | Fenotiazina amb grups etilamino i dos grups metil a l'anell | C.I. 52030 (Basic Blue 24); CAS 1934-16-3 per al clorur | Colorant supravital manual estandarditzat, comparador preferent |
| Blau de metilè ordinari | Fenotiazina bis(dimetilamino) (clorur de metiltionini) | C.I. 52015 (Basic Blue 9); CAS 61-73-4 | Colorant deficient per als reticulòcits, no és un substitut |
| Blau de cresil brillant | Colorant d'oxazina, la formulació varia segons el proveïdor | C.I. 51010; CAS 81029-05-2 o 10127-36-3 segons la forma salina | Colorant supravital acceptable, menys uniforme, no és el comparador harmonitzat |
Una precaució amb els catàlegs: existeix una forma diferenciada de nou blau de metilè com a sal doble amb clorur de zinc, amb CAS 6586-05-6. Per tant, una secció de mètodes ha d'indicar la forma salina i el proveïdor, no només el nom comú.
Què fa realment la tinció supravital
Un reticulòcit és un eritròcit jove que ha perdut el nucli però conserva ARN ribosòmic residual. En una preparació humida sense tenyir, aquest ARN és invisible. El colorant supravital entra a la cèl·lula viva i precipita o agrega aquest ARN en grànuls i filaments blaus, el material reticulofilamentós que s'observa amb immersió en oli. Per tant, la xarxa és un producte de la tinció, no un esquelet preformat que espera rebre color. Per això, les variables del protocol —concentració del colorant, tampó, proporció de sang i colorant, temperatura i temps— importen tant com el nom del colorant.
La conseqüència pràctica és un ordre estricte d'operacions: primer cal barrejar la sang anticoagulada amb el colorant, incubar-la i després preparar els estesos i examinar-los sense fixar i sense contratinció. La fixació abans de la tinció, o una contratinció que amagui els filaments tènues, destrueix la informació de què depèn el recompte.
Un protocol pràctic de reticulòcits amb nou blau de metilè
No hi ha una única formulació universal, de manera que cal indicar quina s'ha utilitzat. Tres variants documentades mostren la diversitat existent.
El procediment clàssic de tipus Brecher utilitza aproximadament un 0.5 per cent de nou blau de metilè amb oxalat de potassi, barrejat a volums iguals amb sang amb EDTA ben homogeneïtzada, i incubat uns 10 a 15 minuts a temperatura ambient. Després de tornar a barrejar suaument, es preparen estesos fins en falca, s'assequen a l'aire i s'examinen sense fixar amb l'objectiu d'immersió en oli de 100x. El procediment de l'NCBI per al recompte de reticulòcits descriu aquest flux de treball i el marc de recompte que s'hi utilitza.
La variant de Dacie i Lewis utilitza un 1.0 per cent de nou blau de metilè en solució salina amb citrat, barrejat amb 2 a 4 volums de sang i mantingut a 37 C durant 15 a 20 minuts abans de preparar els estesos. Una implementació recent d'harmonització del procediment CLSI H44 va utilitzar una solució menys concentrada, del 0.1 per cent, en solució salina tamponada amb fosfat a pH 7.4, amb incubació a 20 C durant 10 minuts i sense fixació, tal com es descriu a l'estudi d'harmonització del NMB de 2026.
Les regles de recompte són comunes a totes les variants. Es compta una cèl·lula com a reticulòcit quan conté almenys dos grànuls o segments de filament diferenciats tenyits de blau, cosa que exclou els dipòsits aïllats de colorant. En el treball rutinari, cal comptar almenys 1,000 eritròcits i expressar els reticulòcits com a percentatge. Amb percentatges baixos, l'estadística exigeix més cèl·lules. Una revisió de la metodologia CLSI H44 assenyala que, amb prop d'un 1 per cent de reticulòcits, calen unes 4,400 cèl·lules per reduir la variació del recompte al 5 per cent, a la revisió del CLSI H44 de De Gruyter. Un disc ocular de Miller facilita els recomptes elevats. Cal filtrar el colorant o preparar-lo de fresc, perquè el precipitat imita les inclusions granulars.
Cossos de Heinz en la mateixa preparació
El mateix estès supravital també pot posar de manifest cossos de Heinz, que són agregats d'hemoglobina oxidada i desnaturalitzada, i no pas ARN residual. En les preparacions amb nou blau de metilè apareixen com a cossos arrodonits, sovint únics i prop de la membrana, tenyits d'un blau més clar que el material reticulofilamentós. Es conserven malament després de la fixació i la contratinció, de manera que cal examinar l'estès sense fixar. Un protocol recent que utilitzava 20 microlitres de sang amb EDTA i 20 microlitres de nou blau de metilè a l'1 per cent, amb 15 minuts d'incubació, va quantificar les cèl·lules positives per a cossos de Heinz entre 250 eritròcits, a l'estudi de PMC que descriu aquest procediment.
Dues distincions eviten interpretacions errònies. En primer lloc, el violeta de metil i el violeta cristal·lí tenyeixen els cossos de Heinz amb més intensitat que el nou blau de metilè, tal com s'indica a la pàgina temàtica de ScienceDirect sobre els cossos de Heinz. El nou blau de metilè és l'opció pràctica quan s'avaluen conjuntament reticulòcits i cossos de Heinz, però no és el colorant específic més intens per als cossos de Heinz. En segon lloc, les inclusions d'HbH en el tret alfa-talassèmic produeixen nombrosos punts fins per tota la cèl·lula després de la tinció supravital, mentre que els cossos de Heinz clàssics són menys nombrosos, més grans i sovint associats a la membrana. El dipòsit de colorant és un tercer element que els pot imitar: es troba fora del pla focal de les cèl·lules i varia entre camps.
Blau de cresil brillant en comparació amb nou blau de metilè
Tots dos colorants són tincions supravitals per als reticulòcits, però l'estandardització afavoreix un d'ells. El mètode de reticulòcits CLSI H44-A2, desenvolupat conjuntament amb el Consell Internacional per a l'Estandardització en Hematologia i recollit a la pàgina de la norma CLSI H44, designa la tinció de sang amb EDTA amb nou blau de metilè com a mètode comparatiu manual. L'ensenyament clàssic d'hematologia coincideix pel que fa a l'aspecte: el nou blau de metilè dona una tinció dels filaments més intensa i uniforme, mentre que el blau de cresil brillant varia més entre lots i mostres.
Aquesta consideració requereix un matís. La guia de l'ICSH per a l'avaluació d'analitzadors accepta la microscòpia manual amb nou blau de metilè com a mètode de comparació de referència, però la qualifica de subjectiva i relativament imprecisa, i prefereix els procediments de referència per citometria de flux quan estan disponibles. Una comparació de 2022 amb 100 mostres va trobar un biaix menor respecte de l'analitzador utilitzat amb blau de cresil brillant que amb nou blau de metilè, tal com es descriu a la comparació de mètodes de tinció de PMC. El resum fonamentat per als estudiants és aquest: utilitzar el nou blau de metilè com a comparador manual estandarditzat, verificar qualsevol mètode local amb blau de cresil brillant respecte d'aquest o d'un mètode automatitzat, i esperar una dispersió més gran de la microscòpia manual en qualsevol cas. La literatura més antiga sobre estandardització també defensava l'Azure B purificat com una alternativa químicament més pura, perquè els lots comercials de colorants variaven, a l'estudi de Marshall sobre Azure B, cosa que explica per què el grau de puresa del reactiu encara apareix en les discussions sobre mètodes.
Com evitar els errors habituals
Quatre errors expliquen la majoria de preparacions fallides. Demanar blau de metilè ordinari en lloc de nou blau de metilè N produeix una tinció feble per motius químics, no tècnics. Fixar o aplicar una contratinció abans de l'observació elimina el senyal supravital. Comptar el precipitat de colorant com a grànuls sobreestima el resultat, cosa que eviten la regla dels dos grànuls i el colorant filtrat. Comptar massa poques cèl·lules quan el percentatge de reticulòcits és baix produeix una xifra aparentment precisa amb límits de confiança amplis. Tots aquests errors tenen el mateix tret distintiu: el microscopista culpa el microscopi d'allò que ja havia determinat l'etapa del reactiu.