Mesura de les espècies reactives d'oxigen en experiments amb blau de metilè

Dos laboratoris duen a terme el que cadascun anomena un experiment antioxidant amb blau de metilè. Un informa que el colorant suprimeix les espècies reactives d'oxigen. L'altre informa que les genera. Tots dos mostren corbes de dosi-resposta ben definides. Tots dos són sincers. La diferència no és el frau ni la incompetència. És que els dos grups han mesurat coses diferents amb una il·luminació diferent, amb sondes que responen a preguntes diferents, i després han descrit totes dues respostes amb la mateixa paraula: ROS.

El blau de metilè és una molècula difícil de mesurar amb precisió perquè participa en la química que se suposa que ha d'observar. A les fosques transfereix electrons entre donadors i acceptors i retorna a la seva forma inicial, a punt per repetir el cicle. Sota la llum es converteix en un fotosensibilitzador i assoleix un estat triplet excitat des del qual pot cedir energia a l'oxigen per formar oxigen singlet o transferir electrons per formar radicals i peròxid d'hidrogen. Qualsevol sonda introduïda en aquest sistema pot ser oxidada, reduïda, decolorada o emmascarada òpticament pel mateix colorant. Per tant, la primera pregunta davant de qualsevol lectura de ROS mai no és quin és el valor. És què detecta realment l'assaig i què fa el colorant a l'assaig.

Amplex Red: un assaig calibrat de peròxid d'hidrogen

La combinació de blau de metilè i Amplex Red és la més defensable en aquesta bibliografia, quan es prepara correctament. La química és específica: la peroxidasa de rave picant utilitza peròxid d'hidrogen per oxidar el substrat Amplex i convertir-lo en un producte fluorescent, la resorufina, amb una estequiometria aproximadament d'un a un. El peròxid de la mostra es converteix en fluorescència al detector. Cap altra espècie de la família habitual de les ROS impulsa directament aquesta reacció.

L'avantatge decisiu és el calibratge. Un investigador rigorós analitza patrons de peròxid coneguts en el mateix tampó, amb les mateixes concentracions de peroxidasa i substrat, el mateix temps d'incubació i els mateixos paràmetres òptics, i després compara les lectures de les mostres amb aquesta corba. En l'estudi amb mitocondris cerebrals aïllats que fonamenta aquest mètode, els autors van fer exactament això: van afegir quantitats conegudes de peròxid al final de cada assaig i van expressar els valors com a taxes en picomols per minut i per mil·ligram de proteïna, en lloc d'unitats arbitràries de fluorescència. Això és el que transforma una resplendor en una mesura.

Hi ha tres detalls d'aquest estudi que val la pena imitar. Primer, els autors van verificar el senyal amb catalasa, que destrueix el peròxid. L'augment de fluorescència induït pel blau de metilè es va aturar quan s'hi va afegir catalasa, fet que confirmava que el senyal corresponia al peròxid i no a un artefacte òptic. Segon, van comprovar directament l'efecte de la il·luminació obturant el feix d'excitació perquè les mostres rebessin una vuitena part de la dosi de llum normal, i el senyal només va disminuir un nou per cent. Més del noranta per cent del peròxid que van registrar era independent de la llum utilitzada per a la mesura. Tercer, van mesurar per separat l'eliminació del peròxid amb un elèctrode i van observar que el colorant augmentava la producció i alhora alentia l'eliminació. Una sonda que només indiqués la fluorescència neta hauria confós aquests dos efectes.

L'assaig encara presenta limitacions, i el blau de metilè en posa de manifest diverses. El colorant absorbeix en una franja àmplia de la mateixa regió vermella on emet la resorufina, de manera que, a concentracions elevades de colorant, la mostra pot emmascarar el seu propi senyal per efectes de filtre intern. Per tant, els patrons han de contenir la mateixa concentració de colorant que les mostres. Amplex Red també es pot fotooxidar per si sol, i el seu producte, la resorufina, pot entrar en cicles fotoredox que generen superòxid i peròxid, cosa especialment important quan l'experiment també il·lumina un fotosensibilitzador. La solució pràctica és irradiar primer les mostres de blau de metilè i analitzar-ne alíquotes amb reactius Amplex a les fosques, en lloc d'il·luminar conjuntament el colorant i la sonda. Finalment, la superòxid-dismutasa no es limita a suprimir un senyal d'Amplex: convertir el superòxid en peròxid pot augmentar-lo. Un control amb SOD que augmenta la fluorescència no ha fallat. Ha identificat el superòxid com a espècie precursora.

DCFDA: un indicador inespecífic d'oxidació

La combinació de blau de metilè i DCFDA és l'origen de bona part de la confusió. DCFH-DA és un precursor que s'introdueix a les cèl·lules. Les esterases de l'interior de la cèl·lula n'eliminen els grups acetat i deixen DCFH no fluorescent, i l'oxidació de DCFH produeix DCF fluorescent. La llista d'agents que l'oxiden és llarga: radicals hidroxil, intermediaris de peroxidasa i del grup hemo, diòxid de nitrogen, àcid hipoclorós i radicals derivats del peroxinitrit. El peròxid d'hidrogen per si sol no l'oxida directament a cap velocitat útil; la fluorescència dependent del peròxid generalment necessita ferro, proteïnes amb grup hemo o reaccions de peroxidasa dins del procés.

La crítica que tota secció de mètodes hauria de citar prové de l'anàlisi de DCFH com a sonda feta per Kalyanaraman i col·laboradors, tal com es resumeix en l'estudi amb mitocondris cerebrals que va descartar DCFDA per aquest motiu. Van demostrar que la sonda reacciona lentament, amb una estequiometria no caracteritzada, sense un calibratge vàlid i amb compostos que no són ROS. La sonda també amplifica allò que mesura: l'oxidació d'un electró de DCFH produeix un radical DCF que reacciona amb l'oxigen per formar superòxid, que es dismuta i genera peròxid addicional. La lectura fabrica, en part, la química que registra.

Res d'això fa que DCFDA sigui inútil. El converteix en una eina de cribratge, no d'identificació. Un augment de la fluorescència de DCF significa que ha augmentat l'oxidació de la sonda dependent d'oxidants. No significa que hagi augmentat el peròxid, i encara menys que hagin augmentat les ROS totals, una quantitat que cap sonda individual mesura. Treballs anteriors amb blau de metilè que es basaven en l'oxidació de DCF per sobre d'un micromolar van descriure efectes prooxidants, mentre que altres sistemes de la mateixa època van mostrar protecció davant la mort cel·lular induïda pel peròxid. Totes dues observacions poden ser certes per al mateix colorant en contextos redox diferents, i el resultat de DCF per si sol no pot indicar quin oxidant era responsable del senyal. La importància del treball anterior amb mitocondris cerebrals és que va substituir aquest cribratge per una mesura calibrada de peròxid i en va detectar directament la càrrega: fins i tot cent nanomolar de colorant augmentaven diverses vegades l'alliberament de peròxid amb tots els substrats i estats respiratoris estudiats.

DCFDA presenta una altra trampa específica del blau de metilè. El colorant té un color intens i és actiu en reaccions redox, de manera que pot decolorar la fluorescència, extingir l'emissió o oxidar els components de la sonda independentment de les ROS cel·lulars. Un control sense cèl·lules, amb colorant i sonda, no és un complement opcional. És l'experiment que indica si el colorant interacciona amb la sonda.

Atr apament d'espín i consum d'oxigen: identitat i flux

Mentre que les sondes fluorescents indiquen que ha aparegut alguna cosa oxidable, la ressonància d'espín electrònic amb trampes d'espín ofereix una indicació més propera de què era. L'estudi clàssic de la fotoquímica del blau de metilè va utilitzar ESR per detectar el radical ascorbat a partir de colorant, ascorbat i llum, i després va demostrar la formació de peròxid en experiments de consum d'oxigen i la formació de radicals hidroxil catalitzada pel ferro en assajos d'atrapament d'espín. Cada tècnica responia a la pregunta que les altres no podien respondre: l'ESR proporcionava la identitat del radical, el consum d'oxigen proporcionava el flux de reacció independentment de qualsevol sonda fluorescent, i la combinació mostrava que les vies de l'oxigen singlet i dels radicals actuaven en el mateix sistema il·luminat.

Aquell resultat de 1984 encara es pot llegir com una advertència. Amb il·luminació i un agent reductor presents, el colorant generava peròxid, i en presència de ferro el sistema produïa el radical hidroxil, l'espècie més reactiva del conjunt. Els autors ho van relacionar amb l'ascorbat de l'ull i van qüestionar-ne l'ús oftàlmic poc rigorós. Els lectors actuals han de tenir presents les condicions: llum més reductor més ferro. Si se n'elimina qualsevol, la via es debilita o desapareix.

Els elèctrodes d'oxigen es guanyen el seu lloc d'una altra manera. Un elèctrode de tipus Clark mesura el consum net d'oxigen, cosa que estableix que la química redox impulsada pel colorant consumeix oxigen molecular i proporciona dades cinètiques que cap artefacte de fluorescència pot falsejar. No identifica el producte. El peròxid, el superòxid, l'aigua i la desactivació de l'oxigen singlet impliquen consum d'oxigen. El flux sense identitat és tan incomplet com la identitat sense flux; per això els treballs sòlids combinen l'elèctrode amb un assaig calibrat de peròxid o amb una trampa.

Per què els resultats antioxidants es contradiuen

Si es comparen les tres lectures, les contradiccions aparents de la bibliografia sobre el blau de metilè s'expliquen per diferències metodològiques i tres fets biològics.

Primer, el colorant és alhora un transportador d'electrons i una font de peròxid. En desviar els electrons dels llocs de la cadena respiratòria on, altrament, l'oxigen es convertiria en superòxid, pot reduir una ROS, mentre que la seva forma reduïda redueix l'oxigen directament a peròxid i n'augmenta una altra. Per tant, un laboratori que estudiï la química redox mitocondrial i el seu paper com a via alternativa ha d'esperar respostes dependents de la sonda: una lectura sensible al superòxid disminueix mentre que una lectura de peròxid augmenta en la mateixa cubeta.

Segon, el peròxid a dosis baixes és un senyal, no només una font de dany. L'estudi amb mitocondris cerebrals de ratolí que va seguir el treball anterior va detectar generació de peròxid amb només cinquanta nanomolar de colorant, sense lesions de l'ADN mitocondrial a nivells terapèutics, amb protecció davant les lesions induïdes per la rotenona després d'un pretractament. Només a cent micromolar, molt per sobre del rang terapèutic, el colorant va danyar determinats fragments d'ADN, i la llum vermella combinada amb vint micromolar de colorant va produir oxigen singlet que va danyar tots els fragments estudiats. El mecanisme proposat és hormètic: una producció lleu de peròxid activa les defenses antioxidants vinculades a Nrf2 i la biogènesi mitocondrial, de manera que una lectura prooxidant a curt termini precedeix un resultat antioxidant a més llarg termini. Un assaig llegit al cap d'una hora i un altre llegit al cap d'un dia poden discrepar perquè la biologia ha canviat entre una lectura i l'altra.

Tercer, la llum determina fins i tot quina molècula hi ha present. La il·luminació desmetila el colorant i genera Azure B i productes relacionats, i el llum del microscopi sobre una placa és suficient per fotosensibilitzar-lo. Els experiments a les fosques i els experiments amb il·luminació són experiments diferents, i la secció de controls d'il·luminació i manipulació del colorant de qualsevol protocol els ha de tractar com a tals.

Un conjunt mínim de controls i com interpretar qualsevol afirmació

La comparació següent és el recurs de referència original d'aquest article. Abans d'acceptar qualsevol resultat de ROS amb blau de metilè, comproveu quines files han cobert els autors i quines han omès.

D'aquí se'n desprèn una regla pràctica de lectura. Amplex amb peroxidasa, calibrat i amb una comprovació amb catalasa, aporta evidència sobre el peròxid. DCFDA aporta evidència sobre l'oxidació inespecífica de la sonda i res més. L'atrapament d'espín amb controls amb captadors de radicals aporta evidència sobre la identitat dels radicals. El consum d'oxigen aporta evidència sobre el flux. Una frase que afirma més del que el seu assaig pot sustentar, per molta seguretat amb què estigui escrita, és una frase sobre la sonda, no sobre el colorant. Les discussions relacionades sobre la dependència de la dosi i el rang hormètic, el flux d'electrons mitocondrial, la interferència en els assajos amb mostres tenyides i els artefactes d'il·luminació en microscòpia amplien cadascun d'aquests punts, i tots continuen sent vàlids un cop se'n substitueix la referència provisional.