Article
Blau de metilè i òxid nítric: NOS, cGMP i senyalització vascular
La pregunta sembla senzilla: el blau de metilè inhibeix l'òxid nítric? Al laboratori, la resposta es divideix en quatre preguntes separades, i cadascuna requereix una prova experimental diferent. Confondre-les és el motiu principal pel qual els textos sobre el blau de metilè i l'òxid nítric semblen segurs però imprecisos.
Penseu en el senyal de l'òxid nítric com una cadena de quatre baules. Es transcriu un gen per produir òxid nítric sintasa. L'enzim converteix l'arginina en òxid nítric. El gas es difon fins a la seva diana abans de reaccionar amb alguna altra cosa. La guanilat ciclasa soluble el detecta i produeix GMP cíclic. S'han publicat efectes del blau de metilè en cada baula, però les proves provenen de preparacions, concentracions i isoformes diferents. Un resultat en una baula no demostra una acció en una altra.
La cadena canònica, explicada de manera planera
A la paret d'un vas sanguini, la seqüència estàndard és la següent. Un estímul actua sobre una cèl·lula endotelial. L'òxid nítric sintasa endotelial, anomenada eNOS o NOS3, produeix un petit pols d'òxid nítric. El gas es difon a la cèl·lula muscular llisa veïna, s'uneix al grup hemo amb ferro reduït de la guanilat ciclasa soluble i accelera la conversió de GTP en GMP cíclic. El GMP cíclic activa la proteïna cinasa G, es modifica la gestió del calci i el múscul es relaxa.
Hi ha una segona cadena que convé mantenir separada. Durant una infecció o l'exposició a citocines, les cèl·lules transcriuen un enzim diferent, l'òxid nítric sintasa induïble o iNOS, també anomenada NOS2. Produeix fluxos d'òxid nítric més grans i més duradors que l'eNOS. Una tercera isoforma, la NOS neuronal o nNOS, pertany a un altre context. Quan un article diu òxid nítric sintasa sense especificar-ne la isoforma, atureu-vos i comproveu quina s'ha mesurat. La visió general de com el blau de metilè transfereix electrons assenyala el mateix sobre les dianes redox en general: el relé no fa res per si sol, i el participant de cada extrem determina el resultat.
El GMP cíclic mesurat també és un indicador integrat, no un assaig enzimàtic directe. El seu nivell reflecteix la síntesi per la ciclasa menys la degradació per les fosfodiesterases, especialment la PDE5 al múscul llis vascular. Per tant, una disminució del GMP cíclic significa que ha arribat menys senyal al detector. Per si sola, no identifica quina baula ha fallat.
Baula 1: es produeix menys enzim iNOS
En macròfags de ratolí estimulats amb lipopolisacàrid bacterià, interferó gamma o tots dos, el blau de metilè va impedir l'augment esperat de la proteïna iNOS i va suprimir intensament l'RNA missatger d'iNOS en els experiments de transcripció en macròfags. La part informativa és allò que no va canviar. La degradació de l'inhibidor I kappa B alfa, la fosforilació de NF kappa B i STAT1, i el desplaçament d'aquests factors cap al nucli es van mantenir en gran part intactes. El que va disminuir va ser la seva unió al DNA, confirmada per immunoprecipitació de la cromatina que mostrava una ocupació reduïda del promotor d'iNOS.
Això és un efecte de regulació gènica que precedeix l'abundància de l'enzim, no un bloqueig agut d'un enzim existent. Pertany a la senyalització inflamatòria, en què els factors de transcripció s'han d'unir a un promotor abans que aparegui la proteïna. No diu res directament sobre l'eNOS constitutiva en un vas en repòs, i s'hauria de descriure en aquests termes.
Baula 2: l'enzim NOS existent funciona més lentament
Un estudi en rates va examinar un nivell diferent. Rates mascle conscients van rebre lipopolisacàrid per via intravenosa i, tres hores després, van rebre solució salina o blau de metilè a 3 mg per kg per via intravenosa. L'activitat de l'òxid nítric sintasa a l'hipotàlem mediobasal es va mesurar mitjançant la conversió d'arginina marcada en citrul·lina en l'estudi de l'activitat de NOS hipotalàmica. L'estrès juntament amb la solució salina, sense lipopolisacàrid, va induir certa activitat independent del calci, i el lipopolisacàrid la va elevar fins a aproximadament deu vegades el nivell del control. El blau de metilè va eliminar tots dos components induïts. L'activitat constitutiva dependent del calci no va canviar en aquell teixit amb aquella dosi i en aquell punt temporal.
Llegiu aquest resultat exactament tal com està escrit: supressió de l'activitat mesurada de tipus iNOS en aquelles condicions. No és una mesura de l'expressió gènica, ni una prova de selectivitat permanent per la iNOS respecte de l'eNOS o la nNOS. El treball amb enzims purificats reforça aquesta cautela. En assaigs directes d'òxid nítric sintasa purificada, el blau de metilè va bloquejar completament la formació de citrul·lina a 30 micromolar, amb una concentració d'inhibició del 50 % propera a 5.3 micromolar sense superòxid dismutasa i a 9.2 micromolar amb aquest enzim, segons la comparació entre NOS purificada i guanilat ciclasa. Un altre estudi amb nNOS purificada va implicar l'oxidació del grup hemo unit a l'enzim. La lliçó pràctica és que la inhibició directa de NOS és real en sistemes aïllats, però el resultat de l'hipotàlem no es pot extrapolar a una afirmació general segons la qual el blau de metilè preserva totes les NOS constitutives a tot arreu.
Baula 3: l'òxid nítric es perd abans d'arribar
La demostració més clara que un mecanisme diferent del bloqueig enzimàtic pot explicar una disminució del GMP cíclic prové de cèl·lules musculars llises de l'artèria pulmonar de conill cultivades. El disseny va prescindir completament de la NOS endògena afegint directament donadors d'òxid nítric, i després va comprovar si el blau de metilè continuava suprimint la resposta del GMP cíclic en l'estudi del superòxid en múscul llis vascular.
Es van provar tres donadors entre 1 i 100 micromolar: S nitroso L cisteïna, nitroprussiat de sodi i un anàleg desaminat estable anomenat MPANO. Tots van elevar el GMP cíclic entre aproximadament 1.5 i 12 vegades. El blau de metilè a 10 micromolar va inhibir els dos primers entre un 51 i un 100 per cent i va deixar inalterada la resposta a MPANO. Si el blau de metilè simplement bloquegés el lloc catalític de la ciclasa, aquesta selectivitat entre donadors seria difícil d'explicar, perquè tots tres convergeixen en el mateix enzim aigües avall.
Tres controls van atribuir aleshores el mecanisme al superòxid. Primer, la generació de superòxid extracel·lular amb xantina i xantina oxidasa va reproduir el mateix patró: bloqueig de CYSNO i del nitroprussiat, però sense afectar MPANO. Segon, el blau de metilè va provocar una producció de superòxid dependent de la dosi i del temps en les cèl·lules musculars llises, mesurada per la reducció del citocrom c. Tercer, la superòxid dismutasa va impedir completament la inhibició, mentre que la catalasa no ho va fer, cosa que apunta al superòxid, i no al peròxid d'hidrogen, com a espècie directament responsable en aquella preparació.
Val la pena descriure la versió de l'experiment amb cocultiu perquè situa l'efecte en l'espai. Es van cocultivar breument cèl·lules endotelials sobre cobreobjectes amb cèl·lules musculars llises, de manera que el factor endotelial alliberat en condicions basals va elevar el GMP cíclic del múscul llis entre tres i vuit vegades. El pretractament de qualsevol dels dos compartiments amb blau de metilè va reduir aquell senyal, i la superòxid dismutasa va revertir parcialment l'efecte del pretractament endotelial. En altres paraules, no cal que el blau de metilè actuï dins la cèl·lula muscular llisa que fa de detector. Pot reduir el senyal eliminant el missatger durant el trajecte. La guia per llegir la recerca sobre el blau de metilè tracta això com una regla general: identifiqueu el compartiment on s'ha fet la intervenció abans d'identificar una diana molecular.
Anomenar això inhibició de NOS seria incorrecte. No calia cap pas de sintasa perquè els donadors funcionessin i, tanmateix, el senyal va disminuir.
Baula 4: el mateix detector respon menys
Existeixen efectes directes sobre la guanilat ciclasa soluble, però les concentracions importen. En la comparació d'enzims purificats citada abans, la ciclasa estimulada per òxid nítric necessitava aproximadament 60 micromolar de blau de metilè per assolir una inhibició del 50 %, enfront de la inhibició del 50 % de NOS prop de 5 a 9 micromolar, i fins i tot 1 mil·limolar només produïa un bloqueig màxim parcial. Això representa una diferència aproximada d'entre sis i onze vegades. Per tant, un experiment cel·lular a una concentració micromolar baixa que redueixi el GMP cíclic no es pot qualificar d'inhibició selectiva de la ciclasa basant-se només en el valor del GMP cíclic.
Un estudi redox posterior va afegir una segona precaució: el blau de metilè desactivava la ciclasa activada per òxid nítric mitjançant un mecanisme diferent de la simple oxidació del ferro del grup hemo per l'aire. Així doncs, el detector pot veure's afectat, però la química no està resolta, i la diferència de concentracions implica que, amb exposicions micromolars baixes, primer cal descartar els efectes del superòxid i de NOS. Aquí també correspon el control de les fosfodiesterases. Si no s'ha mesurat o bloquejat la degradació, una acumulació reduïda de GMP cíclic és compatible amb una síntesi menor, una degradació més ràpida o totes dues.
Per què això no es redueix a una única afirmació sobre la pressió arterial
Cada baula es va establir en un sistema diferent. La transcripció en macròfags no és l'activitat enzimàtica hipotalàmica. L'activitat hipotalàmica després del lipopolisacàrid no és el to endotelial en repòs. El factor endotelial alliberat en condicions basals en cocultiu no és la vasodilatació estimulada per un agonista. Les cèl·lules de l'artèria pulmonar cultivades amb blau de metilè a 10 micromolar no són una circulació humana. Reduir-ho tot a una afirmació com ara que el blau de metilè eleva la pressió arterial bloquejant l'òxid nítric descarta precisament les distincions que els controls es van dissenyar per preservar.
Tres comprovacions mantenen el relat rigorós. Primer, identifiqueu la isoforma: eNOS per al to vascular en repòs, iNOS per al flux inflamatori induït, nNOS per als contextos neuronals i alguns contextos d'enzims purificats. Segon, identifiqueu com s'aporta el senyal d'òxid nítric: síntesi endògena, alliberament endotelial basal o un donador específic com CYSNO, nitroprussiat o MPANO, ja que el donador estable va resistir el blau de metilè mentre que els làbils no. Tercer, identifiqueu la concentració i la reversió: la reversió amb superòxid dismutasa implica el superòxid, la manca d'efecte de la catalasa aporta proves contra el peròxid d'hidrogen en aquella preparació, la reproducció de l'efecte amb xantina oxidasa demostra que el mecanisme és suficient, i els assaigs amb enzims purificats separen els efectes directes sobre la catàlisi de les pèrdues durant el trajecte.
La síntesi breu és aquesta. És més adequat considerar el blau de metilè un agent que altera diversos punts de la senyalització de l'òxid nítric al GMP cíclic que no pas un bloquejador selectiu de la ciclasa. Segons la preparació i la concentració, pot reduir la unió dels factors de transcripció d'iNOS, inhibir directament els enzims NOS, reduir la disponibilitat de l'òxid nítric mitjançant la generació de superòxid i alterar la ciclasa activada per òxid nítric. El paper de la senyalització del GMP cíclic en els estudis vasculars i la comparació dels donadors d'òxid nítric utilitzats en assaigs cel·lulars tracten cadascun una d'aquestes branques amb més detall, i els mètodes utilitzats per separar els efectes redox dels efectes enzimàtics expliquen per què la combinació de superòxid dismutasa, catalasa i un control amb un donador estable apareix tan sovint en aquesta bibliografia.
Un valor baix de GMP cíclic després del blau de metilè identifica una cadena trencada. Només els controls indiquen quina baula s'ha trencat.