Blau de metilè, Nrf2 i biogènesi mitocondrial: una explicació

Hi ha una frase que apareix sovint en els textos sobre el blau de metilè: activa Nrf2 i crea nous mitocondris. La frase es llegeix com una sola afirmació, però conté dos conceptes diferents, estudiats en sistemes diferents i amb tipus de proves diferents. El primer és una via de senyalització, un sensor que activa gens de defensa. El segon és un programa de construcció: una cèl·lula que fabrica més maquinària mitocondrial. Un senyal pot desencadenar la construcció, però demostrar que el senyal s'ha activat no és el mateix que demostrar que l'edifici s'ha aixecat, i demostrar que hi ha més material de construcció no és el mateix que demostrar que el subministrament d'energia ha millorat. Aquest article manté separades aquestes tres coses.

El concepte de Nrf2: un sensor, no un escut

Nrf2 (factor 2 relacionat amb el factor nuclear eritroide 2) és un factor de transcripció, una proteïna que té la funció d'activar gens. En condicions de repòs, una proteïna sensora anomenada Keap1 el reté al citoplasma i el lliura a la maquinària d'eliminació de la cèl·lula perquè el destrueixi contínuament. Quan els oxidants o els electròfils modifiquen les cisteïnes reactives de Keap1, l'eliminació s'atura. El Nrf2 acabat de sintetitzar s'acumula, es desplaça al nucli, s'associa amb petites proteïnes Maf i s'uneix a seqüències d'ADN anomenades elements de resposta antioxidant. Aquesta unió activa tot un conjunt de gens de defensa.

Els indicadors canònics d'aquesta via són específics. NQO1 (NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1) i TrxR1 (tioredoxina reductasa 1) es troben entre els gens diana de Nrf2 més fiables. HO-1 (hem oxigenasa-1) és fortament induïble, però també respon a altres reguladors. Enzims com la SOD i la catalasa formen part de la maquinària antioxidant, però molts factors de transcripció en controlen els nivells; per tant, un augment de SOD no demostra per si sol que Nrf2 en sigui la causa. Les proves més properes a l'esdeveniment de senyalització són l'acumulació nuclear de Nrf2, l'activació d'un reporter ARE o la inducció de dianes canòniques que desapareix quan s'elimina Nrf2. Tota la resta —nivells més baixos d'oxidants, més supervivència en condicions d'estrès, més glutatió— són efectes posteriors que moltes vies poden produir.

El primer resultat amb blau de metilè d'aquesta història se situa prop d'aquest extrem de l'escala. Els fibroblasts exposats a blau de metilè en concentracions nanomolars van mostrar un retard de la senescència, juntament amb un contingut més alt de complex IV, un consum d'oxigen més elevat i la inducció dels enzims de fase-2 TrxR1 i NQO1, tal com es va descriure a l'estudi que va relacionar per primera vegada el blau de metilè amb la millora mitocondrial i el retard de la senescència. TrxR1 i NQO1 són precisament les dianes canòniques de Nrf2 que un lector atent voldria veure. El que l'estudi no va mostrar és l'esdeveniment de senyalització en si: no hi havia cap mesurament de Nrf2 nuclear, cap reporter ARE ni cap control amb inactivació del gen Nrf2. Per tant, la interpretació rigorosa és que el blau de metilè indueix gens diana coneguts de Nrf2 en aquest sistema, cosa coherent amb l'activació de Nrf2, però que no permet identificar Nrf2 com a causa de manera aïllada. La inducció d'un gen diana és un pas posterior a l'activació de l'interruptor.

El concepte de biogènesi: un programa amb tres punts de control

La biogènesi mitocondrial és el programa pel qual una cèl·lula genera més capacitat mitocondrial. La jerarquia que descriuen els manuals passa per tres punts de control. Primer, el coactivador PGC-1alpha activa el programa. Segon, els factors de transcripció nuclears (un dels quals, per afegir confusió, s'anomena NRF1, factor respiratori nuclear 1, una proteïna diferent de Nrf2) impulsen l'expressió de gens mitocondrials, inclòs TFAM, que manté i replica l'ADN mitocondrial. Tercer, la cèl·lula acaba tenint més genomes mitocondrials i més maquinària respiratòria, mesurables com a nombre de còpies de mtDNA, activitat de la citrat sintasa o abundància i activitat dels complexos respiratoris.

Cada punt de control sustenta una afirmació més feble o més forta que l'anterior. Un nivell més alt d'ARN missatger de PGC-1alpha o TFAM mostra que s'ha sol·licitat el programa, no que s'hagi completat. Més mtDNA o més proteïna del complex IV indiquen més material, però els mitocondris remodelats poden presentar el mateix aspecte. Una respiració millor, un consum d'oxigen més elevat o una activitat més alta dels complexos indiquen que la funció ha canviat, però la funció pot millorar sense que es formi cap mitocondri nou. Una afirmació sòlida de biogènesi combina tots tres elements: regulador, contingut i funció.

L'estudi de seguiment amb fibroblasts va recórrer la major part d'aquesta cadena. En cèl·lules humanes IMR90 tractades amb blau de metilè a 100 nanomolar, la relació entre NAD i NADH va augmentar transitòriament en els primers 15 minuts i va tornar al nivell basal en el termini d'un dia. Aquest senyal energètic transitori va anar seguit d'una fosforilació transitòria del sensor energètic AMPK, i després de la inducció de PGC-1alpha i de SURF1, una proteïna necessària per assemblar un complex IV funcional. L'activitat del complex IV es va duplicar aproximadament, els oxidants cel·lulars van disminuir al voltant d'un 28 per cent i els telòmers es van escurçar més lentament. La seqüència completa es descriu a l'article que relaciona l'activitat redox del blau de metilè amb AMPK i la biogènesi mitocondrial.

Dos detalls d'aquest article mereixen atenció perquè són del tipus que sovint s'omet. Primer, el patró va importar més que la presència: el blau de metilè va activar AMPK de manera transitòria, mentre que el fàrmac de referència AICAR la va activar de manera crònica, i l'activador transitori va retardar la senescència amb una eficàcia aproximadament vuit vegades més gran. Una afirmació com ara «el blau de metilè activa AMPK» és, per tant, incompleta; l'afirmació rellevant és que activa AMPK transitòriament, i la comparació suggereix que l'activació crònica no produeix el mateix efecte. Segon, el blau de metilè no va alterar el cicle cel·lular, cosa que descarta l'explicació alternativa més trivial: que les cèl·lules simplement es dividissin més lentament i, per això, semblessin més joves.

La branca dels ratolins: comportament, genomes i un desencadenant deliberadament paradoxal

Un grup que estudiava ratolins de mitjana edat va ampliar el treball en cultius cel·lulars a animals. Després de 60 dies de blau de metilè per via oral, els ratolins tractats van conservar millor la resistència física i el comportament exploratori, i van mostrar menys comportaments semblants a l'ansietat que els ratolins envellits no tractats. Al teixit cerebral, l'expressió de gens que l'envelliment havia reduït —NRF1, TFAM, SOD2 i la subunitat COX1 del complex IV— es va recuperar cap als nivells dels adults, i el nombre de còpies de mtDNA va augmentar. Aquests resultats, que combinen comportament, reguladors i abundància de genomes, es descriuen a l'estudi amb ratolins de mitjana edat sobre el blau de metilè i la biogènesi mitocondrial cerebral.

El desencadenant proposat és la part interessant, perquè contradiu el relat simple segons el qual el blau de metilè és un antioxidant. Els ratolins tractats van mostrar una generació més elevada d'espècies reactives d'oxigen als mitocondris cerebrals, concretament de peròxid d'hidrogen. La proposta dels autors és que un senyal lleu de peròxid activa la via Nrf2, que després impulsa el programa de biogènesi. En aquest model, el blau de metilè és prooxidant en l'etapa desencadenant i antioxidant en l'etapa del resultat, un patró que els farmacòlegs anomenen hormesi, en què un estrès petit provoca una defensa més gran que l'estrès mateix. No es va comprovar directament si aquest augment de peròxid causa realment l'activació de Nrf2; és el pont proposat, no un vincle mesurat.

Un estudi complementari del mateix grup va posar a prova la seguretat d'aquesta proposta. En mitocondris cerebrals aïllats, el blau de metilè va augmentar la producció de peròxid d'hidrogen a concentracions de tan sols 50 nanomolar, però les concentracions terapèutiques no van causar danys detectables a l'ADN mitocondrial. Només a 100 micromolar, molt per sobre dels nivells terapèutics, alguns fragments seleccionats de mtDNA van mostrar danys, i la combinació de colorant a 20 micromolar amb llum vermella va produir oxigen singlet que va danyar el mtDNA de manera generalitzada, cosa que correspon al conegut comportament fotosensibilitzador del colorant, i no a la seva farmacologia en absència de llum. El pretractament fins i tot va protegir els mitocondris del mesencèfal ventral contra les lesions de mtDNA induïdes per la rotenona. La resposta a la dosi i els controls de genotoxicitat es detallen a l'estudi sobre la producció no genotòxica de peròxid pel blau de metilè.

Mesurat o proposat: com llegir el diagrama

El diagrama de la via que es mostra a continuació s'ha dibuixat per a aquest article per remarcar la distinció que el text ha anat establint. Els requadres amb vores contínues són passos amb suport experimental directe en la bibliografia sobre el blau de metilè: cicles redox que modifiquen NAD/NADH, fosforilació transitòria d'AMPK, inducció de PGC-1alpha i SURF1, augment de l'activitat del complex IV, inducció de NQO1 i TrxR1, recuperació de l'expressió de gens de biogènesi i del nombre de còpies de mtDNA al cervell de ratolí, i augment del peròxid sense danys al mtDNA a dosis terapèutiques. Els requadres amb vores discontínues són els vincles proposats: la detecció del senyal de peròxid per Keap1, l'acumulació nuclear de Nrf2 que impulsa els gens de defensa i la fletxa causal de l'activació de Nrf2 al programa de biogènesi. Aquests passos discontinus són plausibles, coherents amb les dades i propis de la biologia clàssica dels manuals, però en aquests articles no es van mesurar amb els controls (Nrf2 nuclear, reporters ARE, inactivació del gen Nrf2) que permetrien convertir-los en requadres continus.

Amb el diagrama al davant es fan evidents tres confusions. Primer, NRF1 i Nrf2 són proteïnes diferents amb noms gairebé idèntics; l'estudi amb ratolins va mesurar el factor respiratori nuclear 1, un regulador de la biogènesi, no el factor de transcripció antioxidant, i confondre'ls redueix tot el diagrama a un sol node. Segon, l'expressió gènica és el començament de la història, no el final; la recuperació dels ARN missatgers de TFAM o COX1 dona suport a una sol·licitud de biogènesi, mentre que el nombre de còpies de mtDNA i l'activitat del complex IV són les proves que la sol·licitud s'ha complert. Tercer, el resultat antioxidant no demostra que s'hagi seguit la via Nrf2; la disminució dels oxidants del 28 per cent en fibroblasts i la protecció contra la rotenona en ratolins són efectes posteriors reals, però diverses vies hi convergeixen.

Què permetria convertir un requadre discontinu en continu

Els experiments que falten són estàndard. Mesurar la proteïna Nrf2 nuclear després de l'exposició al blau de metilè, amb una evolució temporal ajustada al senyal transitori d'AMPK, permetria comprovar si les dues branques s'activen realment alhora, tal com afirma la hipòtesi de l'activació sincronitzada. Un reporter controlat per ARE confirmaria l'activitat transcripcional en lloc d'inferir-la a partir dels gens diana. Repetir els mesuraments de biogènesi amb l'expressió de Nrf2 reduïda o amb el seu gen inactivat permetria comprovar directament la fletxa causal: si la inducció del complex IV i els augments de mtDNA es mantenen sense Nrf2, el pont és incorrecte i la branca d'AMPK produeix l'efecte tota sola. En animals, un estudi d'administració crònica amb els mateixos tres punts de control —regulador, contingut i funció— permetria comprovar si el programa continua actiu o s'adapta. Fins aleshores, l'activació sincronitzada de les vies energètiques i de defensa continua sent allò que els seus autors van dir que era: un possible factor clau, no un mecanisme establert.

Els lectors que arribin des del context més ampli de la farmacologia potser voldran conèixer el marc general: com el blau de metilè transfereix electrons a escala mitocondrial, quins altres efectes té sobre els mitocondris i l'energia cel·lular, quin lloc ocupen els resultats sobre la senescència en la recerca sobre l'envelliment, com es relacionen les afirmacions sobre la biogènesi amb el rendiment cognitiu i quin historial de seguretat delimita qualsevol discussió sobre la dosificació. Cadascun d'aquests és un concepte diferent amb les seves pròpies proves, i cadascun mereix la mateixa distinció entre allò mesurat i allò proposat que aquest article ha aplicat a Nrf2.