Article
El blau de metilè com a indicador d'anaerobiosi i d'oxigen: què demostra el canvi de color
Una tècnica tanca hermèticament un recipient anaeròbic, comprova la tira indicadora de blau de metilè a través de la tapa i veu allò que vol veure. La tira ha passat de blava a blanca. Registra el procés com a anaeròbic i continua amb la feina. Dos dies després, en una placa no hi ha cap creixement, mentre que un tub de brou tancat hermèticament dins del mateix recipient mostra signes d'exposició a l'oxigen. La tira deia la veritat. La tècnica li havia fet la pregunta equivocada.
La confusió és conceptual. Un indicador d'anaerobiosi de blau de metilè es basa en el concepte de redox, no en el d'esterilitat ni en el de validació de tot el sistema. Un cop aquesta distinció queda clara, la tira esdevé un instrument precís i fiable amb una funció molt concreta.
El concepte: un parell redox reversible
El blau de metilè dissolt existeix en dos estats. La forma oxidada és el conegut catió blau. La forma reduïda, anomenada blau de leucometilè, és incolora. A un pH proper al neutre, la semireacció simplificada consisteix en un catió blau més un protó més dos electrons que donen una molècula leuco incolora. El potencial formal és proper a més 11 mil·livolts respecte de l'elèctrode estàndard d'hidrogen a pH 7, cosa que el situa en un rang que molts sistemes reductors poden assolir i que l'oxigen pot revertir.
La reducció necessita un potencial redox local baix. Eliminar només l'oxigen no sempre és suficient. Els primers treballs sobre anaerobiosi van observar que el blau de metilè en aigua sense oxigen ni altres components mantenia el color si no hi havia una substància reductora, i que les mescles de brou de dextrosa amb aproximadament un 0.01 per cent de colorant es decoloraven fàcilment a 37 C, mentre que la mateixa mescla mantinguda a 4 C continuava blava durant un dia, tal com es va descriure en experiments amb teixit fresc i condicions de cultiu anaeròbic. La temperatura, el pH, la glucosa, l'ascorbat, el tioglicolat i l'activitat reductora microbiana determinen si els electrons estan disponibles.
La reoxidació només necessita oxigen. Quan l'aire arriba a la forma leuco, aquesta torna a ser blava. Els indicadors moderns dissenyats específicament aprofiten exactament aquest cicle: colorant més reductor més una matriu estabilitzadora, incolors amb poc oxigen i novament blaus en exposar-se a l'aire, tal com es va demostrar en un indicador d'oxigen híbrid de blau de metilè basat en colorant, reductor, tensioactiu i argila. Aquell prototip utilitzava colorant a 0.01 mil·limolar amb ascorbat o glucosa a 2.0 mil·limolar i pH 11, es tornava incolor prop del 0.5 per cent d'oxigen en volum i distingia entre menys del 0.1 per cent i més del 0.5 per cent d'oxigen a la seva cambra d'assaig.
Per tant, el principi de funcionament és senzill. El blau vol dir que la zona indicadora està oxidada. L'absència de color vol dir que la zona indicadora ha assolit condicions reductores i de baix contingut d'oxigen. El canvi és reversible, local i químic. Per si sol, no diu res sobre els microbis.
Com funciona una tira indicadora de blau de metilè en un recipient anaeròbic
Una tira indicadora de blau de metilè per a un recipient anaeròbic és una petita zona de reacció situada a l'atmosfera del recipient, on es pot veure sense obrir-lo. Els formats comercials varien: tires de paper, comprimits que es dissolen o s'humitegen durant la preparació i papers híbrids més recents. Alguns necessiten una gota d'aigua destil·lada per activar la zona de reacció. D'altres són dispositius de format sec que han de romandre secs. Cal seguir el full d'instruccions del producte concret, perquè la hidratació, la col·locació i el temps de lectura formen part de la química.
A la pràctica, la lectura prevista és binària. El blau vol dir que a la tira persisteix l'oxigen o que les condicions no són prou reductores. El blanc o l'absència de color vol dir que s'han establert condicions redox anaeròbiques a la tira. Alguns papers comercials incorporen un pigment vermell de fons, de manera que el seu estat final reduït es veu rosa en lloc de blanc. Cal saber quin estat final promet el producte abans de valorar-lo.
El temps varia segons el sistema. En un muntatge de tipus GasPak, la decoloració va començar al cap d'aproximadament una hora i es va completar al cap d'unes hores, mentre que en una comparació controlada a temperatura ambient el blau de metilè va necessitar més de sis hores. En aquell treball, el potencial redox dels medis va arribar aproximadament a menys 100 mil·livolts en un termini de 60 a 100 minuts, molt abans que el colorant acabés de canviar, i era força inferior a menys 200 mil·livolts quan la tira va quedar completament incolora. L'indicador respon amb retard respecte de l'atmosfera. Una tira blava a la primera hora no demostra una fallada, i una tira blanca a la sisena hora descriu la tira a la sisena hora.
La col·locació és important pel mateix motiu. Manteniu la tira a l'espai de cap, visible a través de la tapa, lluny de les superfícies d'agar i dels medis de cultiu. Informa sobre el seu entorn immediat. Si la poseu plana contra una paret freda, la deixeu sota les plaques o permeteu que el condensat la xopi, informarà sobre aquell microentorn en lloc de fer-ho sobre el recipient.
Què revela la tira i què no
Considereu l'indicador de blau de metilè del recipient anaeròbic com un únic sensor en un únic lloc. Determina les condicions locals de redox i d'oxigen a la seva pròpia zona de reacció, que són en termes generals representatives de l'espai de cap si la mescla i l'equilibrament són adequats. Tot el que va més enllà és una inferència, i una inferència necessita proves independents.
Una tira incolora no demostra esterilitat. L'esterilitat és l'absència d'organismes viables, demostrada mitjançant una esterilització validada i controls de validació del cultiu. Un recipient pot ser completament anaeròbic i continuar contaminat, o completament estèril i continuar aeròbic.
No valida totes les parts del sistema de cultiu. L'oxigen dissolt dins d'un tub tancat hermèticament, l'oxigen atrapat en agar profund, els gradients en un recipient molt ple i una fuita que s'obre després de la lectura queden fora de l'abast d'una sola tira. Els experiments espacials van mostrar zones blaves i incolores adjacents en un mateix recipient, en les quals la penetració de l'oxigen i l'activitat reductora s'equilibraven de manera diferent. Un punt no pot certificar un volum.
No demostra una anaerobiosi ininterrompuda. Una tira llegida una sola vegada durant la preparació no diu res sobre l'hora vint. Els treballs recents sobre qualitat en anaerobiosi adverteixen que els indicadors químics descriuen l'atmosfera en el moment de la lectura i poden semblar satisfactoris malgrat la presència d'una petita quantitat d'oxigen residual. El que vincula la tira amb la incubació és la documentació contínua o en punts de control, no una sola ullada a l'estat final.
Per conèixer la química que hi ha darrere del canvi de color, vegeu com el blau de metilè alterna entre els estats oxidat i reduït. Per saber de manera més general com l'oxigen condiciona la manipulació de mostres, vegeu el control de l'oxigen en treballs de microscòpia i cultiu.
Un diagrama per tenir al costat del recipient
La figura següent condensa l'article en una referència per a la taula de laboratori. Tres estats de la mateixa tira, les dues direccions de la reacció i el límit entre les proves que aporta l'indicador i la validació del sistema.
| Observació | Lectura legítima | Pas següent necessari |
|---|---|---|
| Tira blava després del temps especificat pel producte | Anaerobiosi no verificada a la tira | Comproveu el tancament hermètic, l'activació i la capacitat del sobre, el catalitzador si escau, la hidratació i la caducitat de la tira; encara no interpreteu els cultius |
| La tira es decolora al llarg d'unes hores i després es manté incolora | Condicions reductores establertes a la tira en aquell moment | Registreu l'hora i el color; manteniu punts de control durant la incubació |
| Tira incolora abans d'obrir i blava després d'obrir | Reoxidació esperada en exposar-se a l'aire | Conserveu la lectura prèvia a l'obertura com a resultat final; no considereu retrospectivament que el procés ha fallat |
| Tira incolora però un tub sembla oxidat | Lectura exclusivament local | Valoreu el tub segons les seves pròpies proves; comproveu els gradients, l'oxigen dissolt i la càrrega |
| Qualsevol color de la tira amb creixement o sense creixement | Cap conclusió sobre l'esterilitat o la viabilitat | Utilitzeu controls d'esterilitat i de viabilitat independents |
Modes de fallada que mantenen la tira blava o donen una falsa sensació de seguretat
La majoria de les fallades s'agrupen en cinc categories. Cadascuna té uns signes característics.
Un recipient o una bossa amb fuites continua aportant oxigen a la zona de reacció. La tira es manté blava o torna a ser blava després de decolorar-se. Comproveu la tapa, la junta, les abraçadores i les superfícies de segellament abans de culpar la química.
Un generador de gas esgotat o activat incorrectament no arriba a eliminar l'oxigen. En els sistemes antics activats amb aigua, l'absència de condensació al cap d'uns 10 a 15 minuts i la manca d'escalfament de la tapa al cap d'uns 20 a 40 minuts eren senyals d'alerta primerenca per a aquell sistema. Un sobre de capacitat insuficient en un recipient sobrecarregat falla de la mateixa manera.
L'enverinament del catalitzador només és aplicable als sistemes antics d'hidrogen i pal·ladi, en què el pal·ladi combina l'hidrogen i l'oxigen per formar aigua. La humitat i el sulfur d'hidrogen el degraden. Molts sobres actuals no utilitzen gens de pal·ladi, de manera que no apliqueu aquesta solució quan no correspongui.
Una tira degradada o manipulada incorrectament falla de manera discreta. El colorant i el reductor perden reversibilitat durant l'emmagatzematge, un dels motius pels quals es van desenvolupar formulacions híbrides resistents a la decoloració per la llum i a la pèrdua de funcionalitat durant l'emmagatzematge. Rebutgeu el material caducat, el que presenta un color inicial anormal i les tires humitejades quan haurien d'estar seques o deixades seques quan cal humitejar-les.
Un gradient o un retard enganya qui fa la lectura, no pas la química. Un espai de cap mal barrejat, els tubs tancats hermèticament amb oxigen dissolt i els medis semisòlids mantenen cadascun les seves pròpies condicions durant més temps del que suggereix la tira. Les tires de resazurina passen pel rosa abans de tornar-se incolores i sovint es comercialitzen com a més ràpides, però els seus llindars són propis de la seva formulació i no es poden traslladar al blau de metilè.
Controls i un protocol de lectura que val la pena copiar
Dos controls econòmics permeten detectar la majoria de les lectures errònies. Manteniu una tira de control nova a l'aire de la sala, al costat del procés. Una tira de blau de metilè que funciona correctament s'hi manté blava. Alguns indicadors envasats comencen amb un color pàl·lid i es tornen blaus en obrir l'envàs, cosa que ja constitueix una comprovació funcional. A més, col·loqueu periòdicament una tira nova en un muntatge anaeròbic validat prèviament. Hauria d'assolir l'estat final reduït validat dins del temps especificat pel producte. Si algun dels dos controls no es comporta com s'espera, substituïu el lot abans de confiar en les lectures del recipient.
El protocol de lectura es deriva del mecanisme. Col·loqueu la tira a l'espai de cap, en un lloc on es pugui veure sense obrir el recipient, seguint el full del producte pel que fa al contacte amb la paret i a la humectació. Registreu el color inicial, l'hora en què es va tancar hermèticament el recipient i el color en el punt de control especificat pel producte. Quan el recipient ho permeti, registreu que l'indicador s'ha mantingut reduït en punts de control definits durant la incubació. Registreu el color final immediatament abans d'obrir. Aquest color previ a l'obertura és el resultat final d'aquell procés. Després d'obrir, espereu que torni a ser blau i no deixeu que això reescrigui l'historial.
Si la tira es manté blava més enllà del temps especificat, considereu que l'anaerobiosi no està verificada. Reviseu la cadena en aquest ordre: tancament hermètic, sobre, catalitzador si n'hi ha, hidratació i caducitat de l'indicador i, finalment, funcionament de l'indicador en comparació amb el control a l'aire. Només quan s'hagi verificat l'atmosfera s'ha d'interpretar el creixement o la seva absència, utilitzant un muntatge de cultiu anaeròbic i controls d'organismes adequats a l'aplicació.
La tira mereix tenir l'última paraula dins del seu propi àmbit. Blava o incolora, respon una pregunta sobre un lloc en un moment concret. Feu-li aquesta pregunta en els moments previstos, amb controls al costat, i respondrà de manera fiable. Pregunteu-li per l'esterilitat, per tots els tubs o per tota la incubació a partir d'una sola ullada, i cap química indicadora no podrà salvar la lectura.