Article
Per què el blau de metilè s'utilitza com a colorant de contrast en la tinció d'acidoresistència
Un tècnic examina un frotis d'esput després de completar tota la seqüència de tinció. Uns bacils vermells destaquen sobre un camp blau, i l'informe indica que s'han observat bacils acidoresistents. L'endemà, un altre portaobjectes mostra un camp blau uniforme sense bacils vermells, i s'informa com a negatiu per a la tuberculosi. Un d'aquests informes afirma més del que permet concloure el portaobjectes, i no és el primer.
La confusió és conceptual. El tècnic va tractar el colorant blau com a part de la química de detecció, com si el blau de metilè ajudés a trobar els micobacteris. No ho feia. Quan el blau de metilè entra en contacte amb el portaobjectes, la prova ja s'ha acabat. El colorant només acoloreix el fons perquè el resultat es pugui llegir. Aquest article explica la funció del blau de metilè en la tinció d'acidoresistència, per què és blau i no d'un altre color, i què permet concloure el vermell sobre el blau.
La resposta breu
La tinció d'acidoresistència és una prova diferencial basada en tres idees. La fucsina fenicada, el colorant primari, es força a penetrar en totes les cèl·lules, inclosos els micobacteris amb una paret cerosa. L'alcohol-àcid, el decolorant, elimina el colorant vermell de les cèl·lules ordinàries, però no aconsegueix extreure'l de les acidoresistents. A continuació, el blau de metilè, el colorant de contrast, tenyeix tot allò que el decolorant ha deixat sense color, de manera que les cèl·lules no acidoresistents, les cèl·lules de l'hoste i les restes apareixen blaves, mentre que els bacils acidoresistents continuen vermells. El colorant de contrast aporta contrast. No intervé en la química que fa que una cèl·lula sigui acidoresistent.
Què fa cada pas
El diagrama següent mostra el repartiment de funcions. Llegeix-lo d'esquerra a dreta com un procediment, i llegeix la franja inferior com un recordatori que cada família de tincions respon una pregunta diferent.
Primer ve la penetració. Els micobacteris resisteixen els colorants aquosos ordinaris perquè el seu embolcall és excepcionalment hidròfob, de manera que el protocol força l'entrada del colorant. En el mètode de Ziehl-Neelsen, l'escalfament fins a l'emissió de vapors fa que la fucsina fenicada, que conté fenol, travessi la paret cerosa. En el mètode en fred de Kinyoun, la calor se substitueix per una formulació del colorant primari molt més concentrada, i algunes versions modificades sense escalfament hi afegeixen tensioactius. Els protocols de tinció d'acidoresistència de l'American Society for Microbiology documenten totes dues formulacions en paral·lel, i la diferència de concentració és notable: aproximadament 0.3 g de fucsina bàsica per 100 mL en el mètode amb escalfament, en comparació amb uns 4 g en el mètode en fred.
En segon lloc ve la diferenciació. L'alcohol-àcid, habitualment 3 mL d'àcid clorhídric concentrat en 97 mL d'etanol al 95 per cent, elimina el colorant vermell de totes les cèl·lules la paret de les quals no ofereix cap resistència especial. Les cèl·lules amb l'embolcall lipídic micobacterià intacte retenen el colorant. Aquest és el pas del qual depèn tot el mètode, i el més sensible a la tècnica, tal com es comenta més avall.
El contrast arriba al final. Ara el portaobjectes conté cèl·lules acidoresistents vermelles sobre un fons gairebé incolor de cèl·lules decolorades. El blau de metilè al 0.3 per cent w/v torna a fer visible aquest fons amb un color que contrasta al màxim amb el vermell. La contratinció és breu, habitualment de 20 a 30 segons en el mètode amb escalfament i fins a uns quants minuts en algunes variants del mètode en fred; el temps depèn del protocol i no és una propietat del colorant mateix.
Per què aquest colorant, i per què blau
El blau de metilè és un colorant bàsic catiònic, cosa que significa que el seu ió acolorit té càrrega positiva i s'uneix a les superfícies amb càrrega negativa dels bacteris decolorats, les cèl·lules de l'hoste i les restes. Microbiologia d'OpenStax descriu aquesta lògica de càrregues com el principi general dels colorants bàsics. Però el blau de metilè no és químicament únic en aquest context. El violeta de cristall i la safranina també són colorants bàsics. L'elecció és òptica, no química.
Els bacils vermells necessiten un fons d'una tonalitat contrastant, i el blau s'oposa al vermell de la manera més útil per a la microscòpia de camp clar. La safranina seria un mal colorant de contrast perquè el seu color final, entre rosa i vermell, és massa semblant al de la fucsina fenicada retinguda i esborra precisament la distinció que ha creat el procediment. El violeta de cristall produiria un fons violeta fosc que competiria amb els bacils vermells fins per captar l'atenció. La prova més clara que la funció és aportar contrast i no intervenir en la química és la substitució: colorants de contrast verds, com el verd de malaquita i el verd brillant, s'utilitzen en alguns protocols veterinaris i modificats, i la prova continua funcionant perquè qualsevol tonalitat clarament diferent compleix la mateixa funció.
Se'n deriven dos corol·laris pràctics. Primer, la fórmula estàndard no especifica cap ajust del pH; no confonguis aquesta solució aquosa simple al 0.3 per cent amb formulacions alcalines com el blau de metilè de Loeffler, que corresponen a un concepte de tinció diferent. Segon, l'excés perjudica. La literatura d'histologia adverteix específicament que un fons blau massa dens pot ocultar bacils escassos, de manera que mantenir el portaobjectes cobert de colorant més temps del que permet el protocol redueix la llegibilitat sense aportar res.
La química de la paret que fa possible la prova
La raó per la qual l'alcohol-àcid discrimina es troba en l'embolcall micobacterià. El seu nucli estructural és el complex micolil-arabinogalactà-peptidoglicà: peptidoglicà unit a arabinogalactà, els extrems externs del qual porten àcids micòlics de cadena molt llarga, que formen una micomembrana externa rica en lípids i de permeabilitat excepcionalment baixa. La revisió de la membrana externa micobacteriana detalla aquesta arquitectura. La barrera actua en totes dues direccions. Resisteix l'entrada del colorant, i per això la penetració requereix calor o un colorant primari més concentrat; també resisteix l'extracció del colorant, i per això l'alcohol-àcid no aconsegueix eliminar la fucsina fenicada un cop és a dins. Els bacteris ordinaris no tenen aquest embolcall i perden el colorant. Per tant, l'acidoresistència s'entén millor com un fenomen de barrera lipídica, no com una unió química de la fucsina a l'àcid micòlic.
Aquesta química també explica una qüestió que sovint desconcerta: els micobacteris es tenyeixen malament i de manera imprevisible amb el mètode de Gram, i de vegades apareixen com formes tènues d'aspecte de rosari o siluetes sense tenyir. La seva paret hidròfoba limita la penetració del violeta de cristall. La tinció d'acidoresistència no és una tinció de Gram modificada. És un principi diferencial diferent, basat en una altra propietat de la paret, tal com mostra la comparació entre la tinció simple i la tinció de Gram per als altres dos mètodes.
Tres mètodes, tres preguntes
| Mètode | Prova realitzada | Resultat positiu | Què demostra el resultat |
|---|---|---|---|
| Tinció simple (p. ex., només blau de metilè) | Cap; un sol colorant tenyeix totes les cèl·lules | Cèl·lules blaves d'una forma determinada | Només la morfologia: forma i disposició, sense classificació |
| Tinció de Gram | Exposició del complex violeta de cristall-iode a alcohol o acetona | Porpra (positiu) enfront de rosa (negatiu) | Comportament de l'embolcall davant l'extracció amb dissolvents; una classificació en dos tipus de paret |
| Tinció d'acidoresistència | Exposició a l'alcohol-àcid de la fucsina fenicada forçada a penetrar en parets ceroses | Vermell (acidoresistent) enfront de blau (no acidoresistent) | Retenció davant l'alcohol-àcid; acidoresistència, que és compatible amb micobacteris però no identifica l'espècie |
Per conèixer la família més àmplia de mètodes bacterians amb un sol colorant, consulta l'atles de tincions per a microscòpia.
Què no pot demostrar el vermell sobre el blau
Els bacils vermells indiquen que els organismes han retingut la fucsina fenicada després de l'exposició a l'alcohol-àcid. Aquesta troballa és compatible amb Mycobacterium tuberculosis, però les directrius dels CDC per al diagnòstic de la tuberculosi assenyalen explícitament que altres micobacteris també són acidoresistents; per tant, la identificació de l'espècie requereix cultiu i proves d'àcids nucleics, no color.
Els errors tècnics es concentren en els dos rentats. Una decoloració insuficient deixa material de fons vermell i afavoreix lectures falsament positives. Una decoloració excessiva elimina el colorant primari retingut feblement i contribueix als falsos negatius. Un colorant de contrast aplicat en excés amaga els bacils escassos dins del blau. Els frotis gruixuts, els reactius precipitats i l'aigua d'esbandida contaminada afegeixen els seus propis artefactes.
La sensibilitat està limitada per la càrrega de microorganismes, per molt acurada que sigui la tècnica. La microscòpia convencional de frotis necessita aproximadament de 5,000 a 10,000 bacils per mil·lilitre d'esput, i revisions anteriors de l'evidència dels CDC situaven la sensibilitat del frotis al voltant del 45 al 80 per cent entre els casos pulmonars confirmats per cultiu. Per tant, un frotis negatiu mai no exclou la tuberculosi. Les directrius actuals dels CDC mantenen el cultiu juntament amb cada frotis i recomanen proves d'amplificació d'àcids nucleics en almenys una mostra respiratòria quan es considera la possibilitat de tuberculosi pulmonar i el resultat canviaria la conducta clínica.
El treball pràctic s'ha de regir per protocols autoritzats
Les descripcions didàctiques, inclòs aquest article, no autoritzen el treball clínic. Per al treball de laboratori, segueix el procediment normalitzat de treball validat del laboratori, d'acord amb els documents vigents dels CDC, l'APHL o el CLSI; la referència dels CDC sobre tinció d'acidoresistència conservada al seu arxiu Stacks mostra com aquests procediments especifiquen els reactius i la lectura dels resultats. El treball amb mostres de tuberculosi requereix contenció: els frotis es preparen en una cabina de seguretat biològica perquè la preparació genera aerosols i esquitxades, i les directrius de seguretat de laboratori dels CDC indiquen que fins i tot els frotis fixats per calor poden contenir bacils tuberculosos viables i s'han de continuar manipulant com a material contaminat. L'entrada de la biblioteca d'imatges de salut pública dels CDC sobre un frotis amb fucsina fenicada i blau de metilè examinat per detectar M. leprae és un recordatori útil de l'abast del mètode més enllà de la tuberculosi: el mateix contrast de vermell sobre blau serveix sempre que es busquen organismes acidoresistents, i una lectura negativa feta amb cura és, per si mateixa, un resultat que val la pena registrar.
Lectura del portaobjectes acabat
El colorant de contrast justifica la seva presència durant l'exploració inicial. Un microscopista que examina la preparació a pocs augments utilitza primer el fons blau per valorar la qualitat del frotis: distribució uniforme de les cèl·lules, cèl·lules intactes de l'hoste per enfocar i absència de precipitats abundants. Les possibles formes bacil·lars vermelles capten aleshores l'atenció precisament perquè res més del portaobjectes és vermell. La confirmació es fa amb immersió en oli, on els bacils veritables mostren les formes esperades de bastonets fins, de vegades lleugerament corbats o d'aspecte de rosari, en lloc de restes uniformes de colorant.
La tinció del fons també determina el vocabulari de l'informe. Un portaobjectes amb bacils vermells s'informa com a «s'han observat bacils acidoresistents», sovint amb una gradació semiquantitativa segons l'escala del laboratori. Un portaobjectes sense organismes vermells s'informa com a «no s'han observat bacils acidoresistents», mai com a «negatiu per a la tuberculosi». La distinció és important perquè el camp blau demostra que la tinció ha funcionat, que les cèl·lules han incorporat el colorant de contrast i que les condicions òptiques eren adequades, però no diu res sobre els organismes que es troben per sota del límit de detecció. Un camp blau sense bacils és un resultat vàlid sobre el portaobjectes, no un veredicte sobre el pacient.
Recorda el repartiment de funcions i els informes es redactaran gairebé sols. La fucsina fenicada detecta possibles candidats. L'alcohol-àcid fa la prova. El blau de metilè només fa que la resposta sigui llegible: el vermell ha retingut el colorant davant l'àcid, el blau l'ha perdut. Tota la resta, l'espècie, la càrrega i el significat clínic, prové del treball que va més enllà del portaobjectes.