Les tincions amb blau de metilè alcalí de Loeffler i policrom, explicades

En una taula de tinció hi pot haver tres ampolles de costat, cadascuna etiquetada amb alguna variant de blau de metilè. Una diu blau de metilè aquós a l'1%. Una altra diu blau de metilè alcalí de Loeffler. La tercera diu blau de metilè policrom. Una persona atrafegada agafa la que té més a prop. Llavors el frotis es tenyeix massa dèbilment, o d'un blau massa uniforme, o amb tons porpres inesperats, i s'atribueix el resultat a la mostra.

És un problema de formulació, no de la mostra. Les tres solucions contenen colorants relacionats, però responen a conceptes de tinció diferents. Una és un colorant catiònic simple amb un pH gairebé neutre. Una altra és el mateix colorant, al qual l'àlcali dona més força. La tercera ja no és un únic colorant, sinó una mescla oxidada deliberadament. Si feu servir la que no toca, el principi de tinció canvia mentre treballeu.

La resposta breu

El blau de metilè aquós simple és el punt de partida: aproximadament un 1% de colorant en aigua, una tinció catiònica simple per observar la morfologia bacteriana i per a la microscòpia general. El blau de metilè alcalí de Loeffler incorpora una petita quantitat mesurada d'àlcali diluït a una solució mare alcohòlica diluïda en aigua; això eleva el pH i afavoreix una unió més intensa del colorant catiònic a les estructures bacterianes àcides. El blau de metilè policrom és blau de metilè que s'ha fet madurar deliberadament per oxidació en un medi alcalí, de manera que l'ampolla conté una mescla d'homòlegs desmetilats (azure A, azure B, azure C), tionina i violeta de metilè, juntament amb blau de metilè residual, i aquesta mescla tenyeix estructures diferents amb tonalitats diferents.

Si només heu de recordar una frase: l'alcalinització canvia la intensitat de la tinció, mentre que la policromació en canvia els colors.

Blau de metilè aquós ordinari: el punt de referència

La formulació més senzilla és blau de metilè dissolt en aigua, habitualment a l'1% w/v, sense àlcali i sense oxidació. L'espècie acolorida és el catió metiltionini amb un contraió clorur, un petit colorant fenotiazínic pla descrit a la fitxa del blau de metilè de PubChem com a clorur de metiltionini. Com a catió, s'uneix als esquelets fosfat dels àcids nucleics i als grups àcids de les parets cel·lulars bacterianes, i acoloreix les cèl·lules de blau sobre un fons clar.

La seva virtut és la predictibilitat. Els nuclis i els bacteris apareixen blaus. El contrast és modest. Els microorganismes poc visibles poden tenyir-se dèbilment, que és precisament la limitació que Loeffler es va proposar corregir. Per conèixer la família més àmplia de tincions bacterianes simples a la qual pertany aquesta solució, consulteu una visió general de la tinció bacteriana simple. També aquí cal rigor en la identificació: el blau de metil és una molècula completament diferent, tal com explica la comparació entre el blau de metil i el blau de metilè, de manera que una cerca al catàleg basada només en el nom del color pot acabar proporcionant una classe de colorant equivocada.

Blau de metilè alcalí de Loeffler: el mateix colorant, amb més força

La recepta clàssica de Loeffler combina una solució mare alcohòlica de blau de metilè amb àlcali diluït en aigua. Les versions dels manuals indiquen 0.3 g de colorant en 30 mL d'etanol al 95% més 100 mL d'hidròxid de potassi aquós al 0.01% (o, de manera equivalent, 30 mL de solució alcohòlica saturada de blau de metilè, 100 mL d'aigua destil·lada i 1 mL de KOH a l'1%), cosa que dona una solució de treball amb prop d'un 0.3% de colorant i un pH clarament alcalí. Les versions comercials segueixen el mateix principi, i el catàleg de colorants per a microbiologia de Thermo Fisher presenta el blau de metilè alcalí de Loeffler juntament amb les variants policroma i aquosa com a articles de catàleg diferents, cadascun amb usos previstos diferents.

L'àlcali és la idea clau. L'augment del pH desprotona els grups carboxil i fosfat de la mostra, fet que incrementa la densitat de llocs amb càrrega negativa, mentre que la solució mare d'etanol manté el colorant completament dissolt perquè arribi a aquests llocs en forma monomèrica. El resultat és una tinció dels bacteris més ràpida i intensa que la que proporciona el colorant aquós neutre, amb els coneguts bacils i cocs d'un blau intens d'un frotis bacteriològic rutinari. El temps de tinció acostuma a ser d'un a tres minuts, seguit d'una esbandida amb aigua.

L'aplicació clàssica és Corynebacterium diphtheriae cultivat en medi de sèrum de Loeffler: bacils prims, sovint en forma de maça, amb grànuls metacromàtics de Babes-Ernst de polifosfat emmagatzemat intensament tenyits. L'associació entre medi i tinció és històrica, tots dos atribuïts al mateix bacteriòleg, i el contrast dels grànuls és el valor diagnòstic que aporta. Més enllà del treball amb la diftèria, la tinció serveix com a tinció bacteriològica general per a frotis de cultius, per observar la morfologia de Neisseria en frotis clínics i sempre que no calgui una tinció de Gram però el blau aquós simple resulti massa tènue. És una tinció monocroma. Tot allò àcid pren alguna tonalitat de blau. Quan un protocol requereix una diferenciació per color, l'àlcali per si sol no la pot proporcionar.

Una precaució pràctica: les solucions alcalines de colorant es deterioren i precipiten amb l'emmagatzematge i l'absorció de diòxid de carboni. Els laboratoris preparen volums modestos o compren la solució de catàleg i en respecten la vida útil, en lloc de continuar fent servir una ampolla vella que ara deixa sediment a cada portaobjectes.

Blau de metilè policrom: un nom, diversos colorants

El blau de metilè policrom parteix del mateix colorant, però el sotmet a una oxidació controlada en medi alcalí, anomenada històricament maduració o policromació. L'envelliment en medi alcalí, l'escalfament amb carbonat o l'oxidació amb agents com el dicromat eliminen progressivament grups metil dels substituents dimetilamino. El producte és una mescla: blau de metilè residual més azure B (pèrdua d'un metil), azure A i azure C (desmetilació addicional), tionina (completament desmetilada) i productes secundaris d'oxidació de la família del violeta de metilè. Cada component té la seva pròpia tonalitat i afinitat tissular, de manera que la mescla tenyeix metacromàticament: els nuclis, els grànuls, les mucines i el cartílag adquireixen cadascun tons diferents que van del blau al porpra vermellós.

Aquesta és la mateixa química que hi ha darrere de les famoses tincions de sang. Els primers investigadors van observar que el blau de metilè alcalinitzat tenyia els nuclis dels paràsits de la malària amb tons porpres, però les seves solucions aquoses madurades eren inestables i precipitaven al cap de pocs dies. La revisió de com es va inventar la tinció porpra de sang ressegueix com Malachowski i Romanowsky van aprofitar aquest efecte de manera independent el 1891, com es va introduir el metanol per estabilitzar el precipitat del colorant i fixar els frotis sense calor, i com Giemsa va estandarditzar més tard la mescla al voltant de quantitats mesurades d'azure B més eosina, amb estabilització mitjançant glicerol. Les tincions modernes de tipus Giemsa deriven directament del blau de metilè policrom més eosina, la combinació que produeix l'efecte Romanowsky. Per conèixer en detall l'associació amb l'eosina i el component azure B, consulteu les tincions de tipus Romanowsky i la interacció entre azure B i eosina.

Com que és una mescla, el blau de metilè policrom és, per naturalesa, el menys estandarditzat dels tres. L'equilibri exacte de tonalitats depèn de la via i del grau d'oxidació; per això els proveïdors d'histologia el venen com un producte diferenciat, amb les seves pròpies proves de rendiment, i no com un Loeffler envellit. Els usos habituals inclouen la visualització metacromàtica de grànuls de mastòcits, mucines i cartílag, els detalls dels plasmòcits i Helicobacter pylori en seccions de teixit mitjançant mètodes policroms de tipus Goodpasture. És l'opció adequada quan es busca diferenciar per color, i l'opció equivocada quan el protocol espera una silueta bacteriana monocroma i nítida.

Comparació de formulacions i finalitats

Llegiu la taula com un procediment de decisió. Si la mostra es tenyeix massa dèbilment, canvieu el plantejament del pH i trieu Loeffler. Si tot es tenyeix però res no es distingeix, canvieu el plantejament del colorant i trieu el policrom. Si un frotis amb Loeffler mostra els grànuls magníficament però el supervisor pregunta per què els nuclis i el citoplasma comparteixen el mateix blau, la resposta és que cap tinció alcalina monocroma pot fer aquesta feina. Aquesta qüestió correspon a la família policroma i als seus derivats per a la tinció de sang.

Com evitar les confusions habituals

Dos errors expliquen la major part de la confusió. El primer és considerar Loeffler intercanviable amb el blau de metilè simple perquè tots dos semblen blaus dins de l'ampolla. Difereixen en pH i intensitat, i substituir-lo per un colorant neutre quan s'especifica Loeffler fa perdre precisament el contrast dels grànuls entorn del qual es va dissenyar el protocol. El segon és considerar policrom qualsevol blau alcalí vell o envellit accidentalment. L'envelliment no controlat produeix una mescla desconeguda amb una concentració desconeguda, mentre que les veritables solucions policromes es preparen mitjançant vies d'oxidació definides i, en la línia de les tincions de sang, es combinen amb quantitats mesurades d'eosina. La història és il·lustrativa en aquest punt: les solucions aquoses madurades i inestables de la dècada de 1890 van deixar pas a formulacions metanòliques estabilitzades precisament perquè les mescles no controlades no es podien reproduir, una lliçó que val la pena recordar abans de tenyir un portaobjectes diagnòstic amb una ampolla d'antiguitat incerta.

El rigor amb els noms tanca el cercle. Confirmeu a l'etiqueta l'article de catàleg (aquós, Loeffler o policrom), el contingut de colorant i l'aplicació prevista, en lloc de deduir-los pel color. Les tres formulacions comparteixen un cromòfor d'origen. No comparteixen una finalitat.