Može li metilensko plavilo zaobići mitohondrijski kompleks III? Zašto se studije ne slažu

Dvije laboratorije ispitivale su može li metilensko plavilo zaobići blokirani mitohondrijski kompleks III. Jedna je odgovorila da ne može. Druga je odgovorila da može. Obje su imale podatke.

Prva studija, na mitohondrijama iz mozga miševa, pokazala je da boja to ne može. Druga, na mitohondrijama iz mozga triju vrsta glodara, pokazala je da djelimično može. Treća studija, na jetri miševa, često se navodi uz njih, ali je ispitivala nešto drugo. Kada se ona stavi u odgovarajući kontekst, pola zabune nestaje.

Nema univerzalnog mehanizma koji se može proglasiti. Postoje tri eksperimenta s različitim blokatorima, dozama i mjerenim pokazateljima. Prvo pročitajte uslove. Iz njih slijede zaključci.

Šta ovdje znači zaobilaženje

Elektroni ulaze u lanac kroz kompleks I (iz NADH) ili kompleks II (iz sukcinata), prolaze kroz kompleks III do citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kisika. Gradijent koji se pritom stvara ćelija koristi za proizvodnju ATP-a.

Tvrdnja o zaobilaženju znači da metilensko plavilo preuzima elektrone prije mjesta blokade i predaje ih nakon njega. Oksidirana boja preuzima elektrone iz NADH ili početnih komponenti lanca i postaje leukometilensko plavilo, a reducirani oblik predaje ih citohromu c ili ih vraća u lanac. Ako se predaja odvija nakon mjesta blokade, respiracija i membranski potencijal djelimično se oporavljaju. Ako se odvija na mjestu blokade ili prije njega, nema oporavka.

Jedan detalj kompleksa III u velikoj mjeri određuje ovaj spor. U kompleksu se odvija Q-ciklus s dva mjesta vezivanja inhibitora. Antimicin se veže za mjesto Qi. Miksotiazol se veže za mjesto Qo. Studija koja koristi samo jedan od njih ispitala je samo polovinu kompleksa.

Prva studija: nema zaobilaženja u mitohondrijama iz mozga miševa

Gureev i saradnici koristili su mitohondrije iz moždane kore miševa C57BL/6, izolirane digitoninom, i ispitivali ih pri koncentraciji od 0.1 mg proteina po ml. Supstrati su obuhvatali tri režima: piruvat i malat, svaki pri 5 mM, sukcinat pri 10 mM uz glutamat pri 2 mM te L-prolin pri 10 mM. Blokatori su bili rotenon pri 1 mikromolar (kompleks I) i antimicin pri 1 mikrogram po ml (kompleks III). Doze boje bile su 0.5, 1 i 2 mikromolar, uz 1 mikromolar kao glavnu koncentraciju. Metode i zapisi mjerenja dostupni su u kratkom radu u časopisu FEBS Letters.

Zaobilaženje kompleksa I funkcioniralo je. Rotenon je smanjio respiraciju stimuliranu ADP-om s približno 121 na približno 2 nmol po minuti po mg, a boja pri 1 mikromolar vratila ju je na približno 21. Membranski potencijal oporavio se uz piruvat i malat te uz L-prolin.

Zaobilaženje kompleksa III nije funkcioniralo. Antimicin je smanjio respiraciju na približno 16, a boja ju je povećala samo na približno 20. Membranski potencijal nije se oporavio ni uz jedan supstrat, pri dozama boje do 5 mikromolar. Podaci o peroksidu upućivali su na isto: sama boja povećala je oslobađanje peroksida s bazalne stope blizu 76 pmol po minuti po mg na približno 1170, 1460 i 1945 pri trima dozama, ali je antimicin smanjio taj signal izazvan bojom za približno 25, 88 i 96 posto, redom. Da je reducirana boja direktno reagirala s kisikom, blokiranje kompleksa III ne bi trebalo potisnuti signal. Autori su zaključili da se reducirana boja oksidira na mjestu Qo kompleksa III, prije mjesta blokade antimicinom. Kratka petlja, opisana riječima: donori predaju elektrone boji, boja ih predaje mjestu Qo, a dalje slijedi uobičajeni put. Rotenon se zaobilazi. Antimicin se ne zaobilazi.

Druga studija: djelimično zaobilaženje kod tri vrste, na oba mjesta vezivanja inhibitora

Svab i saradnici proširili su eksperimentalni dizajn. Koristili su mitohondrije iz mozga miševa, štakora i zamoraca, izolirane Percollom, i ispitivali ih pri istoj koncentraciji od 0.1 mg po ml, uz piruvat i malat ili glutamat i malat, svaki pri 5 mM. Koristili su dva blokatora kompleksa III: antimicin A pri 0.3 mikromolar i miksotiazol pri 1 mikromolar. Boja je bila pri 2 mikromolar u većini mjerenja, a pri 0.5 u ispitivanjima citohroma c. Sve tri vrste, ispitane usklađenim protokolima, obuhvaćene su radom s otvorenim pristupom.

Obje blokade djelimično su zaobiđene kod sve tri vrste. U mitohondrijama miševa antimicin je potisnuo respiraciju, a boja ju je povećala za približno 60 posto, s približno 37 na 59 nmol po minuti po mg. Miksotiazol ju je potisnuo za 88 posto, na približno 4.5, a boja ju je povećala peterostruko, na približno 23. Membrana se djelimično repolarizirala uz bilo koji inhibitor, što je mjereno dvjema bojama (safraninom O i ratiometrijskim TMRM-om) kako bi se isključili optički artefakti.

Ovaj rad je također direktno ispitao predaju elektrona, što prva studija nije učinila. Egzogeni acetilirani citohrom c pri 25 mikromolar nije bio reduciran djelovanjem energiziranih mitohondrija, ni s inhibitorima ni bez njih, ali je dodavanje boje pokrenulo redukciju u oba slučaja. U puferu bez ćelija, NADH i boja reducirali su citohrom c brzinom proporcionalnom NADH-u. Duži prijenos, opisan riječima: redukcijski ekvivalenti prelaze na boju, boja ih direktno predaje citohromu c, a kompleks IV kisiku. Taj put u potpunosti preskače kompleks III, pa se oba blokatora mogu zaobići.

Dva dodatna pokazatelja podupiru takvo tumačenje. Fluorescencija NAD(P)H opala je kada je boja dodana mitohondrijama tretiranim miksotiazolom, što znači da su redukcijski ekvivalenti odlazili novim putem. Apsorbancija boje pri 660 nm pratila je svako uzastopno dodavanje, dok su supernatanti nakon centrifugiranja pokazali da se oksidirana boja više od stostruko koncentrira unutar energiziranih mitohondrija, a zatim ih napušta kada potencijal kolabira. Uklapa se i bilans protona: preskakanje koraka pumpanja ostavlja približno 2 protona po paru elektrona umjesto 10, pa brža potrošnja kisika uz samo djelimičnu repolarizaciju predstavlja obrazac stvarnog zaobilaženja, a ne dokaz protiv njega.

Isti preparat davao je odgovore koji se lako pogrešno protumače pri površnom čitanju. Uz inhibitor i boju, ADP je smanjivao respiraciju umjesto da je povećava, a blokada transporta stimulirala ju je umjesto da je usporava, dok se membranski potencijal i dalje mijenjao u uobičajenim smjerovima. Sama potrošnja kisika u ovom sistemu navodi na pogrešan zaključak.

Treća studija: studija jetre koja je ispitivala komplekse I i II, a ne III

Lee i Boelsterli koristili su mitohondrije iz jetre miševa i kultivirane hepatocite oštećene efavirenzom (kompleks I, IC50 blizu 30 mikromolar) i hidrazinom, metabolitom izoniazida (kompleks II, IC50 blizu 30 mikromolar). Boja pri približno 30 mikromolar obnovila je oksidaciju NADH, membranski potencijal i ATP, uz smanjenje oksidansa i nekrotične smrti. Rad u časopisu Redox Biology predstavlja model u kojem boja prenosi elektrone zaobilazeći oštećene komplekse I i II.

Taj rezultat predstavlja potvrđeni kontekst za dio lanca prije kompleksa III i ne govori ništa o kompleksu III jer u njemu taj kompleks nije bio blokiran. Ne može potvrditi ni opovrgnuti nijednu od studija mozga.

Matrica uslova

Četiri razloga zbog kojih obje studije kompleksa III mogu biti tačne za vlastite eksperimentalne uslove

1. Blokator nije predstavljao istu intervenciju. Sam antimicin pri 1 mikrogram po ml naspram antimicina pri 0.3 mikromolar uz zaseban blokator mjesta Qo. Put kojim boja dovodi elektrone na mjesto Qo ne uspijeva upravo tamo gdje direktni put do citohroma c uspijeva. Jedno mjesto ne može predstavljati oba.

2. Doza boje i vrijeme mjerenja razlikovali su se. Glavne koncentracije bile su 1 naspram 2 mikromolar, kod spoja koji prolazi kroz redoks cikluse i čije preuzimanje i direktna redukcija citohroma c zavise od koncentracije i vremena. Male razlike u dozi uz različito vrijeme mjerenja mogu otkriti različite ogranke iste mreže.

3. Preparati su se razlikovali. Izolacija digitoninom naspram izolacije na gradijentu Percolla odabire mitohondrijske populacije koje se preklapaju, ali nisu identične. Koncentracija proteina bila je usklađena na 0.1 mg po ml, pa se ta varijabla može isključiti, ali subpopulacija i integritet ne mogu. A vrsta je isključena kao objašnjenje: druga grupa reproducirala je svoj fenotip i kod miševa.

4. Supstratni uslovi određuju šta boja može učiniti. Tri supstratna režima naspram parova povezanih s NADH. Dostupnost NADH i membranski potencijal zajedno određuju koliko se brzo boja reducira i gdje se raspoređuje, a put koji zahtijeva reduciranu boju uz oksidirani citohrom c zavisi od tog izbora.

Kako čitati sljedeću tvrdnju o zaobilaženju

Provjerite koji je kompleks blokiran, kojim inhibitorom, na kojem mjestu i pri kojoj dozi. Provjerite koncentraciju boje i vrijeme mjerenja. Provjerite tkivo, vrstu, način izolacije, koncentraciju proteina i supstrat. Provjerite i slažu li se potencijal, respiracija, redoks stanje i direktno ispitivanje predaje elektrona, jer je sama potrošnja kisika ovdje više puta upućivala na pogrešan zaključak.

Uski sažetak ostaje valjan. O zaobilaženju kompleksa I bojom postoji saglasnost. Kada je riječ o kompleksu III, mitohondrije miševa uz antimicin pri 1 mikrogram po ml i boju pri 1 mikromolar ne pokazuju funkcionalno zaobilaženje, dok tri vrste uz antimicin pri 0.3 mikromolar ili miksotiazol pri 1 mikromolar i boju pri 2 mikromolar pokazuju djelimično zaobilaženje uz direktan prijenos elektrona s boje na citohrom c. Te tvrdnje mogu istovremeno biti tačne. Svaki širi zaključak predstavlja ekstrapolaciju.

Povezano štivo smješta spornu tvrdnju u okvir nesporne hemije: kako metilensko plavilo prenosi elektrone za prijenos elektrona, eksperimenti zaobilaženja kompleksa I za potvrđeni slučaj u ranijem dijelu lanca, mjerenja membranskog potencijala i njihovi artefakti za objašnjenje zašto su bile potrebne dvije boje te laboratorijsko rukovanje spojevima koji prolaze kroz redoks cikluse za zamke vezane za doziranje i vrijeme mjerenja.