Metilensko plavilo i vid: šta pokazuju istraživanja mrežnice i gdje su njihove granice

Čitalac pronađe studiju u kojoj je metilensko plavilo zaštitilo mrežnicu, pa postavi prirodno pitanje: treba li ga primijeniti u oko? Istraživanja metilenskog plavila i vida ne odgovaraju na to pitanje jer nijedna od ključnih studija nije ispitivala takvu primjenu. U jednoj je boja ubrizgana u staklovinu miševa zajedno s toksinom. U drugoj je dodana u medij koji okružuje izolirane ćelije u posudi. U trećoj je stavljena u vodu za piće miševima s mutacijom. Svaki rezultat vezan je za svoj put primjene i svoj model.

Ovaj članak razmatra tri pretkliničke studije, dva tipa ćelija mrežnice i granicu između zaštite u laboratoriju i kliničkog liječenja oka. Obrazac je dosljedan: metilensko plavilo može mijenjati mitohondrijski stres u ćelijama mrežnice u kontroliranim uslovima, a taj nalaz ne opravdava primjenu maloprodajnih rastvora na oko.

Dva tipa ćelija, dvije različite bolesti

Mrežnica je slojevita, a sloj je važan. Svjetlost prvo pada na fotoreceptore u vanjskom dijelu mrežnice. Njihovi signali prolaze kroz posredničke neurone do ganglijskih ćelija u unutrašnjem dijelu mrežnice, čiji aksoni izlaze kroz vidni živac. Dijagram u nastavku prikazuje slojeve redom.

Ganglijske ćelije mrežnice ugrožene su kod glaukoma i optičke neuropatije. Kada se u pretragama spominju metilensko plavilo i glaukom, obično se misli na ovaj unutrašnji sloj i njegove aksone. Fotoreceptori su ćelije ugrožene kod degeneracije vanjskog dijela mrežnice. Imaju najveće energetske potrebe u mrežnici i rade blizu granice svog respiratornog kapaciteta, zbog čega im ostaje malo rezerve kada mitohondrijski kompleks I zakaže. Rezultat za jedan tip ćelija ne može se prenijeti na drugi, a tri studije u nastavku razmatraju ih odvojeno. Opća vještina razlikovanja modela od zaključaka objašnjena je u članku kako čitati istraživanja metilenskog plavila.

Ganglijske ćelije u oku živog miša

U najranijoj od tri studije istraživači su modelirali optičku neuropatiju mikroinjekcijom rotenona u staklovinu jednog oka miša, dok je drugo oko služilo kao kontrola s nosačem. Rotenon blokira mitohondrijski kompleks I, ulaznu tačku koja prenosi elektrone s NADH dalje. Disfunkcija kompleksa I ujedno je obilježje koje povezuje ovaj model s Leberovom nasljednom optičkom neuropatijom, bolešću ganglijskih ćelija i vidnog živca.

Dvadeset četiri sata kasnije sloj ganglijskih ćelija u očima tretiranim rotenonom bio je tanji i sadržavao je manje ćelija nego u kontrolnim očima. Kada je metilensko plavilo ubrizgano zajedno s rotenonom, to oštećenje spriječeno je u zavisnosti od doze, pri čemu je najviša ispitana doza (0.07 mg/kg, znatno ispod LD50 za miševe) očuvala i debljinu sloja i broj ćelija. Paralelna ispitivanja u homogenatima mozga pokazala su dva učinka: metilensko plavilo poništilo je oksidativni stres izazvan rotenonom i poništilo pad potrošnje kisika. Autori su predložili ekscitotoksični mehanizam u kojem rotenon oštećuje amakrine ćelije koje moduliraju aktivnost, ganglijske ćelije prekomjerno aktiviraju, a antioksidativno djelovanje prekida nastalo oštećenje. Predložena hemijska osnova te zaštite detaljno je opisana u članku mitohondrijski mehanizmi metilenskog plavila.

Ovaj rezultat ima tri ograničenja. Boja je ubrizgana zajedno s toksinom direktno u oko, što predstavlja način primjene, a ne raspored liječenja. Period posmatranja trajao je 24 sata. A izmjerene vrijednosti citohrom-oksidaze porasle su u obje grupe s oštećenjem, što su autori protumačili kao prekomjernu aktivnost, a ne kao dokaz obnovljene respiracije u živoj mrežnici.

Ganglijske ćelije izolirane u posudi

Druga studija potpuno je isključila oko kao cjelinu. Istraživači su izolirali primarne ganglijske ćelije mrežnice mladih štakora i izložili ih rotenonu, induktoru apoptoze staurosporinu ili niskom nivou kisika tokom 72 sata, a zatim izmjerili preživljavanje bojenjem koje razlikuje žive i mrtve ćelije. Metilensko plavilo u koncentracijama od 1 i 10 mikromolara u mediju za kulturu poboljšalo je preživljavanje pri svakom od tih štetnih djelovanja, približno 1.5 do 1.9 puta, zavisno od uslova. Dodatno ispitivanje pokazalo je da je metilensko plavilo očuvalo aktivnost citohrom c oksidaze pri izlaganju vodikovom peroksidu.

Ovo je farmakologija izoliranih ćelija. Spoj je dopirao do ćelija difuzijom kroz medij za kulturu pri definiranoj koncentraciji, bez rožnice, suznog filma, leće, staklovine, krvotoka ili imunološkog sistema na tom putu. Upravo je ta jednostavnost svrha modela: pokazuje da same ganglijske ćelije mogu biti zaštićene kada spoj dođe do njih. Ne govori ništa o tome bi li kap na površini rožnice dovela do bilo kakve definirane koncentracije u unutrašnjem dijelu mrežnice. Koncentracije iznad 10 mikromolara izbjegavane su zbog toksičnosti za iste ćelije, što podsjeća da odnos doze i odgovora u posudi djeluje u oba smjera.

Fotoreceptori kod miševa s mutacijom i u ćelijskoj liniji

Treća studija bavi se vanjskim dijelom mrežnice. Istraživači su koristili Harlequin miševe, koji imaju nedostatak faktora koji inducira apoptozu, zbog čega kompleks I ostaje nepotpuno sastavljen, i ispitali strukturu fotoreceptora, markere vanjskih segmenata i integritet mitohondrija u dobi od 11 mjeseci. Metilensko plavilo davano je sistemski u vodi za piće nakon odbijanja od sisanja, u količini od oko 10 mg/kg dnevno. Tretirani miševi s mutacijom zadržali su veću debljinu mrežnice, više markera rodopsina i opsina te zdraviju strukturu mitohondrija od netretiranih miševa s mutacijom.

Prateći rad na ćelijama koristio je ćelije 661W, besmrtnu mišju ćelijsku liniju sličnu fotoreceptorima, izloženu rotenonu s metilenskim plavilom ili bez njega tokom 24 sata. Preživljavanje se poboljšalo pri 30 mikromolara, a niže koncentracije normalizirale su omjer NADH prema NAD+ i smanjile oksidativni stres. Posebno se ističe ono što metilensko plavilo nije učinilo: nije obnovilo ATP. Zaštita je bila povezana s ublažavanjem redoks stresa i smanjenom aktivnošću puteva odgovora na stres, uključujući mitohondrijski odgovor na nesavijene proteine i markere mitofagije, a ne s obnovljenom opskrbom energijom.

Ta razlika važna je za tvrdnje o metilenskom plavilu i mrežnici. Spoj može održati fotoreceptor pod stresom u životu bez otklanjanja njegovog energetskog deficita, što svako terapijsko tumačenje ograničava na redoks stres, a ne na opće podmlađivanje.

Tri studije uporedo

U poređenju u nastavku svaka studija označena je prema modelu i putu primjene jer te dvije kolone određuju koje zaključke rezultat može podržati.

Svaki red predstavlja pretkliničko istraživanje. Nijedna studija nije uključila pacijente, mjerila vid niti ispitivala oftalmološku formulaciju.

Zašto ovo nije liječenje glaukoma

Liječenje glaukoma snižava intraokularni pritisak. Neuroprotekcija nastoji postići nešto drugo: održati ganglijske ćelije i njihove aksone u životu pod stresom. Navedene studije pripadaju drugom pristupu, a ne prvom. Nijedna nije snizila pritisak i nijedna nije uporedila metilensko plavilo s liječenjem koje snižava pritisak. Zato ustaljeni pristupi glaukomu i kontroli pritiska ostaju zasebno pitanje u odnosu na redoks neuroprotekciju i zato se rezultat o preživljavanju ćelija ne može tumačiti kao očuvan vid.

Razlike u putevima primjene dodatno potvrđuju tu razliku. Intravitrealno ubrizgavanje zajedno s toksinom smješta poznatu količinu uz mrežnicu u trenutku oštećenja. Primjena putem vode za piće izlaže cijelu životinju tokom više mjeseci, uz nepoznatu koncentraciju u mrežnici. Medij za kulturu direktno izlaže same ćelije. Nijedan od tih načina ne predviđa koji bi dio lokalno primijenjene doze prošao kroz rožnicu, izbjegao uklanjanje suzama, prošao kroz leću i staklovinu te stigao do bilo kojeg sloja mrežnice u korisnoj koncentraciji. Taj problem dopremanja dio je šireg pitanja puteva primjene i distribucije metilenskog plavila, pri čemu svaki put zahtijeva vlastita mjerenja koncentracije.

Razlike među tkivima predstavljaju drugu prepreku. Boja koja dođe do prednjeg dijela oka nije time stigla do njegovog stražnjeg dijela, a koncentracija koja koristi jednom sloju može oštetiti drugi. Maloprodajni rastvori ne proizvode se, ne steriliziraju, ne puferiraju niti konzerviraju kao oftalmološki pripravci, a čistoća, pH, osmolalnost i pomoćne tvari važni su za izlaganje rožnice i unutrašnjosti oka. Ništa u ovim nalazima na mrežnici ne opravdava stavljanje takvih rastvora u oko ili na njegovu površinu. Pitanja standarda pripreme pripadaju temi sigurnosti i rukovanja metilenskim plavilom.

Gdje prestaju dokazi

Posmatrana zajedno, ova tri rada podržavaju usku tvrdnju: u kontroliranim uslovima metilensko plavilo može ublažiti mitohondrijski redoks stres u neuronima mrežnice i očuvati njihovu strukturu. Tvrdnja prestaje važiti izvan tih uslova. Modeli s toksinima i genetskim poremećajima kompleksa I nisu glaukom, druze niti dijabetička bolest. Kratki periodi posmatranja i strukturni ishodi nisu trajno očuvan vid. A zaštitna koncentracija u jednom odjeljku nije doza za drugi.

Za snažnije dokaze bili bi potrebni zasebni elementi: definirana izloženost mrežnice nakon klinički primjenjivog puta primjene, funkcionalni ishodi vida kod životinja, korist nezavisna od pritiska u modelu relevantnom za glaukom, a zatim podaci o sigurnosti i djelotvornosti kod ljudi. Dok takvi podaci ne postoje, veza metilenskog plavila i vida ostaje istraživačka hipoteza s jasnim granicama: farmakološko djelovanje na mitohondrije u mrežnici je uvjerljivo, ali je pokazano samo u ćelijama i životinjama, bez osnove da se iz ovih studija pređe na liječenje očiju.