Metilensko plavilo, tau i amiloid: zašto se mehanizmi uklanjanja proteina razlikuju

Pitajte šta metilensko plavilo radi proteinima povezanim s Alzheimerovom bolešću i čut ćete jedan samouvjeren odgovor tamo gdje biste trebali čuti tri odgovora s jasno navedenim ograničenjima. U epruveti ometa međusobno povezivanje tau proteina. U jednom mišjem modelu smanjuje rastvorljivi amiloid, a tau ostavlja nepromijenjenim. U drugom smanjuje aktivnost enzima koji proizvodi amiloid. Svaki od ovih nalaza je stvaran. Nijedan ne predstavlja cijelu sliku, a svi se ne javljaju u istoj životinji u isto vrijeme. Ovaj članak razdvaja ta tri nalaza kako se rezultat jednog eksperimenta više ne bi navodio kao dokaz za drugi.

Čitaoci koji žele širu sliku o tome kako metilensko plavilo djeluje unutar ćelija trebaju početi od tog članka. Čitaoci koji žele znati je li išta od ovoga pomoglo pacijentima trebaju pročitati pregled kliničkih nalaza u Alzheimerovoj bolesti, gdje pripadaju ishodi ispitivanja na ljudima. Ovaj članak ne ponavlja taj pregled.

Nalaz o tau proteinu odnosi se na testove agregacije

Najstariji od ova tri nalaza potječe iz istraživanja tau proteina u sistemima bez ćelija. Tau je protein koji formira neurofibrilarne spletove. U testu vezivanja tau-tau, fragmenti tau proteina udružuju se u uparene spiralne filamente, a fenotiazinske boje, uključujući metilensko plavilo, blokiraju to udruživanje pri niskim mikromolarnim koncentracijama. Kasnija biohemijska istraživanja dala su hemijsko objašnjenje: boja oksidira cisteinske ostatke na tau proteinu, čime stabilizira monomerni oblik i suzbija nastanak fibrila koje bi inače rasle. Prijavljene inhibitorne koncentracije za agregaciju tau proteina kreću se približno od jednocifrenih mikromolarnih vrijednosti do nekoliko desetina mikromola, što je raspon važan za sve što slijedi.

Obratite pažnju na vrstu ove tvrdnje. Ona ne govori ništa o proizvodnji tau proteina, njegovoj fosforilaciji u živom mozgu ili njegovom uklanjanju. Govori da u definiranim uslovima u epruveti oksidirana boja sprečava slaganje tau proteina. To je precizan, ograničen i koristan rezultat. Problem nastaje kada se on proširi u opću tvrdnju da metilensko plavilo uklanja patološke promjene povezane s tau proteinom, jer podaci iz istraživanja na životinjama ne podržavaju takvu verziju.

Nalaz o proteasomu odnosi se na miševe 3xTg-AD i pokazao je različite ishode za amiloid i tau

Eksperiment koji najjasnije pokazuje razdvajanje ishoda jeste 16-sedmično istraživanje primjene putem hrane kod miševa koji nose tri mutacije povezane s Alzheimerovom bolešću. Od dobi od šest mjeseci životinje su jele hranu koja je sadržavala metilensko plavilo, a istraživači su istovremeno mjerili tri stvari: proteasom, nivoe amiloida i tau.

Aktivnost proteasoma se promijenila. Aktivnost slična himotripsinskoj porasla je za približno četvrtinu, a aktivnost slična tripsinskoj za približno polovinu, dok se treća katalitička aktivnost nije značajno promijenila. Rastvorljivi amiloid-beta 40 i 42 smanjili su se, svaki za približno četvrtinu. Autori su ovo protumačili kao povećano uklanjanje, a ne smanjenu proizvodnju, jer se prekursorski protein i fragmenti nastali njegovom obradom nisu promijenili, dok su se učenje i pamćenje poboljšali u probnom testu u vodenom labirintu.

Zatim slijede ishodi koji se nisu mijenjali zajedno. Nerastvorljivi amiloid nije se promijenio. Bojenje kojim se otkrivaju plakovi nije se promijenilo. Ukupni ljudski tau i fosfo-tau na treoninu 181 nisu se promijenili, kao ni nepravilna lokalizacija tau proteina. Ni mitohondrijski pokazatelji nisu se promijenili: nije bilo značajnog efekta na aktivnost citokrom-c oksidaze, količinu proteina te oksidaze ili ATP. Dakle, u ovom modelu i pri ovom režimu primjene, metilensko plavilo povećalo je dvije od tri aktivnosti proteasoma, smanjilo rastvorljivi amiloid i popravilo jedan pokazatelj ponašanja, dok su ishodi za tau, nerastvorljivi amiloid i ispitani mitohondrijski ishodi ostali nepromijenjeni.

Jedno ograničenje dodatno pojašnjava ovaj zaključak. Ovi miševi u ispitanoj dobi još nisu razvili agregate tau proteina, pa eksperiment ne može pokazati da metilensko plavilo ne djeluje protiv tau spletova. Pokazuje da rastvorljivi amiloid može opasti dok se izmjereni ishodi za tau ne mijenjaju, što je upravo vrsta rezultata u kojoj se jedan protein promijenio, a drugi nije, potrebna za razumijevanje ove teme. Ako ste ovdje došli vjerujući da aktivacija proteasoma metilenskim plavilom istovremeno uklanja oba karakteristična proteina, ovo istraživanje ispravlja tu pretpostavku.

Nalaz o proizvodnji amiloida odnosi se na stare miševe PSAPP i proturječi prethodnom mehanizmu

Druga istraživačka grupa, drugi model i suprotno objašnjenje ranijeg koraka u procesu. U tromjesečnom istraživanju primjene sondom kod miševa PSAPP starih 15 mjeseci, dnevna oralna doza od 3 mg/kg smanjila je opterećenje plakovima u različitim regijama mozga za približno trećinu do polovine i smanjila nekoliko frakcija amiloida, uključujući oligomere mjerene namjenskim testom. Međutim, ovdje je predloženi mehanizam bio smanjena proizvodnja, a ne brže uklanjanje: količina proteina BACE1 u mozgu opala je, njegov proizvod C99 također je opao, dok se glasnička RNA nije smanjila, što upućuje na efekat na nivou proteina, a ne na smanjenu ekspresiju gena.

Istraživanja na ćelijama dodatno su potkrijepila ovo objašnjenje. U testu bez ćelija s rekombinantnim enzimom, metilensko plavilo direktno je inhibiralo BACE1, a u ćelijama jajnika hrčka koje eksprimiraju ljudski prekursorski protein amiloida, izlučeni amiloid 40 i 42 smanjili su se već pri koncentracijama od 1.56 mikromola, dok je sam prekursor ostao nepromijenjen. Uporedite to s prethodnim istraživanjem, u kojem su fragmenti nastali obradom prekursora ostali nepromijenjeni, a efekat je pripisan uklanjanju. Oba nalaza ne mogu opisivati isti univerzalni mehanizam jer se razlikuju modeli, dob, doze, putevi primjene i trajanje. Upravo je to poenta. Efekti metilenskog plavila na amiloid ostvaruju se putem proizvodnje u jednim eksperimentalnim uslovima, a putem uklanjanja u drugim. Navođenje bilo kojeg nalaza bez njegovih eksperimentalnih uslova navodi na pogrešan zaključak.

Jedna hemijska reakcija, više meta: oksidacija cisteina kao poveznica

Treći pravac istraživanja objašnjava kako se jedna redoks reakcija može pojaviti u nepovezanim nalazima o proteinima. U biohemijskom istraživanju inhibicije kaspaza, metilensko plavilo inaktiviralo je kaspazu-6 oksidacijom njenog katalitičkog cisteina u sulfensku kiselinu, što je potvrđeno masenom spektrometrijom, pri koncentraciji za polumaksimalni efekat od približno 10.6 mikromola. Kaspaza-3 bila je inhibirana pri sličnoj koncentraciji. Autori su ovo izričito povezali s literaturom o tau proteinu: ista reakcija oksidacije cisteina za koju je predloženo da održava tau u monomernom obliku može inaktivirati cisteinsku proteazu, a efektivne koncentracije se preklapaju.

Ovo je elegantno objašnjenje, ali i upozorenje. Redoks-aktivna molekula koja oksidira izložene cisteine imat će više od jedne mete pri bilo kojoj koncentraciji pri kojoj djeluje. Nalaz o razgradnji agregata tau proteina, nalaz o kaspazama, a možda i drugi nalazi, dijele istu hemijsku radnju primijenjenu na različite proteine. Ta zajednička radnja ne čini nalaze međusobno zamjenjivim. Ona znači da doza i kontekst određuju koja je meta važna te da dugotrajna primjena usmjerena na jedan proces ovisan o cisteinu može zahvatiti i druge, što su autori istraživanja kaspaza izričito istakli. Povezana pitanja o tome kako redoks hemija metilenskog plavila određuje njegove mete, šta aktivacija proteasoma znači za druge agregirane proteine i mijenja li dugotrajna primjena profil meta zaslužuju zasebnu obradu.

Mehanizam prema ishodu: koji nalaz pripada kojem modelu

Čitajte tabelu red po red i zaključak je jasan. Nijedan red ne pokazuje promjenu u svakoj koloni. Najuvjerljiviji rezultat o proizvodnji amiloida potječe iz istraživanja u kojem proteasom nikada nije ispitan. Najuvjerljiviji rezultat o proteasomu potječe iz istraživanja u kojem se obrada prekursora uopće nije promijenila. Nalaz o tau proteinu uglavnom se odnosi na eksperimente u epruvetama i na hemijsku reakciju koja zahvata i enzime izvan namjeravane mete. Svako ko spoji ove kolone u jednu tvrdnju, da metilensko plavilo uklanja patološke proteine kao grupu, piše pregled eksperimenta koji nikada nije proveden.

Ta disciplina vrijedi i za pacijente. Dovode li ovi mehanizmi zajedno do kliničke koristi zasebno je pitanje, s vlastitim ispitivanjima i zaključcima. Odgovor se nalazi u pregledu kliničkih dokaza za Alzheimerovu bolest, a ne ovdje.