Metilensko plavilo za MS: objašnjenje istraživanja EAE-a na životinjama

Pretragom metilenskog plavila za MS pronaći ćete radove koji naizgled odgovaraju na isto pitanje. Međutim, to nije tako. U jednom radu bolesnim miševima davano je metilensko plavilo kao tretman. U drugom njime nije tretirana nijedna životinja. Metilensko plavilo korišteno je kao plava boja na tankim presjecima kičmene moždine kako bi patolog mogao vidjeti mijelin pod mikroskopom.

Na toj razlici zasniva se cijeli članak. Boja ima dvije uloge u biologiji, a zajednička im je samo bočica. Kao kandidat za lijek, daje se živoj životinji, a pitanje je da li se bolest mijenja. Kao boja za tkivo, nanosi se na mrtvo, fiksirano tkivo nakon eksperimenta, a pitanje je kako je tkivo izgledalo. Ako previdite tu razliku, odjeljak o patološkim metodama čitat ćete kao da predstavlja rezultat tretmana.

Šta je EAE, jednostavnim riječima

Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, obično skraćen kao EAE, standardni je životinjski model za pojedine aspekte multiple skleroze. Istraživač imunizira osjetljivog miša fragmentom mijelinskog proteina uz snažan adjuvans. Imunološki sistem zatim napada vlastiti centralni nervni sistem životinje. Kod miša se razvija slabost koja se širi uzlazno i lako se ocjenjuje na skali od 0 do 5, od mlitavog repa do paralize stražnjih udova.

Jednostavnost tog ocjenjivanja objašnjava zašto je EAE popularan, ali i zašto može navesti na pogrešne zaključke. MS kod ljudi nastaje spontano, uključuje širi i manje jasno definiran skup meta te izaziva vidne, senzorne, kognitivne, cerebelarne i motoričke simptome uz relapsni ili progresivni tok. EAE u kontroliranim uslovima reproducira odabrane mehanizme, poput upale, demijelinizacije i oštećenja aksona. Ne reproducira MS u malom. Čitaoci koji žele razumjeti širi okvir mogu proučiti pretpostavljene načine djelovanja metilenskog plavila na ćelijskom nivou prije nego što procijene bilo koju pojedinačnu tvrdnju o bolesti.

Dva rada u nastavku koristila su i različite antigene za EAE, što je važno. Studija tretmana izazvala je bolest pomoću MOG35-55, kratkog peptida iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina. Studija patologije izazvala je bolest pomoću MP4, fuzijskog proteina sastavljenog od segmenata mijelinskog bazičnog proteina i proteolipidnog proteina. Izbor soja i antigena mijenja mjesta pojave lezija i ponašanje upale, pa ove dvije studije nisu dva ponavljanja istog eksperimenta.

Pregled: od modela preko pitanja do ograničenja

Držite ovu tabelu otvorenom. Ona je osnovni pregled za ovaj članak. Svaki red navodi na koje kliničko pitanje model može odgovoriti, šta je stvarno mjereno i gdje prestaje mogućnost primjene nalaza na ljude.

	Studija tretmana (MOG EAE)	Studija patologije (MP4 EAE)
Rad	Studija tretmana EAE-a izazvanog MOG peptidom	Longitudinalna studija patologije MP4
Uloga metilenskog plavila	Intervencija primijenjena na živim miševima	Boja nanesena na fiksirane presjeke kičmene moždine debljine 1 mikrometar
Kliničko pitanje na koje može odgovoriti	Da li primjena mijenja težinu EAE-a i imunološku signalizaciju	Kako se demijelinizacija i oštećenje aksona razvijaju tokom šest mjeseci
Ishodi	Dnevne kliničke ocjene, infiltrati u kičmenoj moždini, demijelinizacija, oštećenje aksona, signalizacija AMPK i SIRT1, aktivnost NF-kB, ravnoteža Th17 i Treg	Površina lezija, stepeni upale i edema, gustoća demijeliniziranih vlakana, g-omjer utvrđen elektronskom mikroskopijom, aksonoliza, oticanje mitohondrija, razmak između neurofilamenata
Ograničenje primjene nalaza na ljude	Jedan soj, jedan spol, kratak tok od 30 dana, povezanost bez dokaza mehanizma	Nije ispitan nijedan tretman, presječno uzorkovanje tkiva, lezije uzorkovane uglavnom u lumbalnom dijelu kičmene moždine

Svako ko provjerava naredni naslov može ponovo koristiti iste kolone uz pomoć članka kako čitati pretkliničke studije: provjerite vrstu i antigen, ulogu spoja, ishode i da li rezultat prikazuje tok bolesti ili stanje tkiva u određenom trenutku.

Rezultat tretmana: šta je primjena promijenila

Studija tretmana iz 2016. u časopisu Journal of Neuroimmunology koristila je ženke miševa C57BL/6, stare približno 8 do 10 sedmica, imunizirane sa 250 mikrograma MOG35-55 po mišu. Nakon indukcije, životinje s EAE-om nasumično su raspoređene u grupu koja je primala metilensko plavilo ili u netretiranu grupu s EAE-om, a kliničke ocjene praćene su približno do 30. dana.

Kliničke ocjene bile su značajno niže kod tretiranih miševa nego kod kontrolnih miševa s EAE-om od 15. do 30. dana, uz P manje od 0.01. Analiza kičmene moždine pokazala je isti obrazac, s manje upalne infiltracije, manje demijelinizacije i manjim gubitkom aksona kod tretiranih životinja.

Posebnost studije bio je skup mjerenja signalizacije. Tretman je povećao aktivaciju AMPK i ekspresiju SIRT1 te potisnuo aktivaciju NF-kB, ključnog prekidača upalnog odgovora. U adaptivnom imunološkom odgovoru smanjio je odgovor Th17 i pojačao odgovor Treg. Predloženi slijed stoga ide od metilenskog plavila preko AMPK i SIRT1 do smanjene signalizacije NF-kB, zatim do pomaka s upalnog odgovora Th17 prema regulatornom odgovoru Treg, blažeg oštećenja tkiva i nižih ocjena.

Taj slijed je tumačenje, a ne dokazan uzročno-posljedični niz. Studija pokazuje da su primjena lijeka, promjene signalizacije i ublažavanje bolesti bili povezani. Ne dokazuje da AMPK i SIRT1 posreduju u cjelokupnom korisnom učinku, a javno indeksirani tekst ne navodi dovoljno jasno tačnu dozu u miligramima po kilogramu, način primjene, dan početka ili trajanje da bi se režim mogao reproducirati samo na osnovu sažetka. Svaku brojčanu dozu navedenu uz ovaj rad na prodajnoj stranici smatrajte neprovjerenom, osim ako se poziva na metode iz punog teksta. Širi skup dokaza o metilenskom plavilu kod ljudi mjesto je za provjeru da li je ovaj rani imunološki nalaz ikada doveo do kliničkih podataka.

Rezultat patologije: šta je tkivo pokazalo tokom šest mjeseci

Studija MP4 iz 2015. u časopisu PLoS ONE koristila je ženke miševa C57BL/6 imunizirane sa 200 mikrograma MP4 u kompletnom Freundovom adjuvansu, uz toksin pertusisa na dan imunizacije i ponovo 48 sati kasnije. Nijedna životinja nije primila metilensko plavilo kao lijek. Nakon fiksacije i uklapanja, poprečni presjeci kičmene moždine debljine jednog mikrometra obojeni su metilenskim plavilom za svjetlosnu mikroskopiju, dok je elektronska mikroskopija ventrolateralnog trakta korištena za detaljniji prikaz.

Tkivo je uzorkovano u tri faze: na vrhuncu akutne faze kod 7 miševa, tri mjeseca nakon početka kod 5 miševa i šest mjeseci nakon početka kod 10 miševa. Prosječne kliničke ocjene u tim fazama izgledale su gotovo identično, približno 1.7 do 1.8 na skali od 0 do 5. Tkivo je pokazalo drugačiju sliku. Gustoća vlakana s izoliranim oštećenjem mijelina porasla je s približno 569,000 vlakana po kvadratnom milimetru na vrhuncu akutne faze na približno 1,496,000 nakon šest mjeseci, uz značajnu razliku između akutne i dugoročne faze pri P jednakom 0.027. Kombinirano oštećenje mijelina i aksona približno se udvostručilo do šestog mjeseca. Vlakna u remijelinizaciji ostala su ispod jednog procenta u svakoj fazi, što umanjuje očekivanja u pogledu obnove.

Oštećenje aksona slijedilo je obrazac u obliku slova U: bilo je izraženo na vrhuncu akutne faze, manje nakon tri mjeseca i najveće nakon šest mjeseci, a koreliralo je s oticanjem mitohondrija i smanjenim razmakom između neurofilamenata. Procjena je provedena bez uvida u ocjenu i fazu, što dodatno podržava tumačenje da kliničke ocjene nisu u potpunosti odražavale strukturno oštećenje koje se nastavilo.

Taj nesklad je stvarni doprinos studije čitaocu zainteresiranom za MS. Stabilna ocjena onesposobljenosti nije značila stabilno stanje tkiva. To također pokazuje zašto ovaj rad ne može podržati nikakvu tvrdnju o metilenskom plavilu kao tretmanu za MS. Ispitivao je vrijeme, a ne tretman.

Zašto nijedna studija ne dokazuje korist kod pacijenata

Svaki rad posmatrajte kao dobar odgovor na usko pitanje, bez ikakvog odgovora na pitanje o učinku kod pacijenata.

Prvo, uzrok se razlikuje. EAE se namjerno izaziva definiranim antigenom i adjuvansom. MS kod ljudi razvija se spontano, uz širi imunološki repertoar koji uključuje T ćelije, B ćelije, urođeni imunitet i rezidentne glijalne ćelije. Spoj koji mijenja odgovor usmjeren prema MOG-u kod miša ne mora promijeniti taj širi odgovor kod ljudi.

Drugo, fenotip se razlikuje. Uzlazna slabost koja se kod miša širi od repa do stražnjih udova praktičan je pokazatelj. Ona svodi heterogenost MS-a kod ljudi na jedan broj koji opisuje motoriku. Lijekovi često mijenjaju kratkoročne ocjene EAE-a bez promjene toka bolesti kod ljudi, zbog čega je EAE alat za preliminarno ispitivanje i proučavanje mehanizama, a ne minijaturna klinika.

Treće, izloženost i vrijeme primjene ostaju nerazjašnjeni. Kontinuirana rana primjena u eksperimentu na miševima koji traje 30 dana nije isto što i hronična oralna upotreba kod osobe s već razvijenom bolešću, a nijedna studija nije mjerila nivoe lijeka u nervnom sistemu. Bez te veze nije moguće povezati koncentraciju na laboratorijskoj ploči ili dozu kod miša s režimom primjene kod ljudi.

Četvrto, ova dva rada ne potvrđuju rezultate jedan drugog. Različiti antigeni, različita pitanja, različiti ishodi i, u jednom slučaju, potpuno odsustvo tretmana. Njihovo zajedničko citiranje kao dvije pozitivne studije tretmana MS-a predstavlja grešku u kategorizaciji.

Šta ovo znači za čitaoce koji procjenjuju dokaze

Ovi radovi ne utvrđuju protokol primjene metilenskog plavila za MS. Studija tretmana podržava daljnje istraživanje AMPK, SIRT1, NF-kB i ravnoteže između Th17 i Treg u MOG EAE-u. Studija patologije podsjeća da oštećenje tkiva može napredovati dok ocjene djeluju nepromijenjeno i da metilensko plavilo u odjeljku o metodama ponekad označava posudu s bojom, a ne lijek. Čitaoci koji prate istraživanja multiple skleroze koja su u toku trebaju imati na umu tu razliku između boje i lijeka. Pitanja sigurnosti, uključujući rizike povezane s krvlju i interakcijama, treba razmotriti s kliničarem uz opće podatke o sigurnosti metilenskog plavila prije nego što bilo ko postupi na osnovu naslova o laboratorijskim nalazima.

Zaključak staje u jednu rečenicu. Jedna citirana studija davala je metilensko plavilo miševima s MOG EAE-om i zabilježila blažu bolest uz pomak imunološkog odgovora prema smanjenoj upali, dok druga citirana studija nije davala nikakav tretman i koristila je metilensko plavilo samo za bojenje kičmene moždine, dokumentirajući šest mjeseci nakupljanja oštećenja mijelina i aksona, pa ta dva rada ne dokazuju da metilensko plavilo pomaže kod MS-a kod ljudi.