Metilensko plavilo i feroptoza: željezo, lipidna peroksidacija i ćelijska smrt

Feroptoza je ćelijska smrt uzrokovana oštećenjem membrane. Polinezasićene masti u membranama oksidiraju u lančanoj reakciji, membrana gubi funkciju i ćelija umire. Za ovu hemijsku reakciju potrebno je željezo. Ta rečenica obuhvata cijeli koncept, a sve u ovom članku predstavlja provjeru jednog njegovog dijela.

Ovdje je pitanje uže: kako metilensko plavilo djeluje na taj lanac u eksperimentima na ćelijama i šta taj rezultat zapravo pokazuje. Kratak odgovor glasi da je u dvije laboratorijske studije metilensko plavilo u nanomolarnim koncentracijama smanjilo mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju i održalo ćelije živim nakon izlaganja okidačima koji inače izazivaju feroptozu. Duži odgovor važniji je zato što je svaka karika u lancu ispitana drugačijom intervencijom, a svaka intervencija ima ograničenja.

Feroptoza u jednom odlomku

Membranski fosfolipid s repom polinezasićene masne kiseline ima slabu tačku: atome vodika koji se lako oduzimaju. Kada radikal oduzme jedan od njih, kisik se veže za lipid, nastaje lipidni peroksilni radikal, a taj radikal oduzima atom vodika sljedećem lipidu. Reakcija se širi duž membrane dok je nešto ne zaustavi.

Glavni mehanizam zaustavljanja je enzim GPX4, koji koristi glutation da lipidne perokside reducira u bezopasne lipidne alkohole. Laboratorijski okidači napadaju ovu odbranu na određenim mjestima. Erastin blokira unos cistina putem sistema xc-minus, čime ćeliji uskraćuje cistein potreban za sintezu glutationa. Butionin sulfoksimin direktno blokira sintezu glutationa. RSL3 inhibira sam GPX4. Sva tri ostavljaju perokside neuklonjenim, ali djeluju u različitim koracima, pa se rezultat dobijen s jednim okidačem ne može automatski primijeniti na ostale.

Feroptoza se od apoptoze razlikuje po svojstvima koja je definiraju. Nema kaspazne kaskade ni apoptotičnih tjelešaca. Kelatori željeza, poput deferoksamina, i sredstva koja hvataju radikale, poput ferrostatina-1, suzbijaju je. To je praktični test kojim istraživači utvrđuju da je smrt feroptotična, a ne samo nekrotična. Širi pregled puteva regulirane ćelijske smrti stavlja ovu razliku u kontekst, a način na koji ćelije upravljaju labilnim željezom objašnjava zašto je kelacija tako presudna kontrola.

Uloga mitohondrija i zašto je bila sporna

Rani radovi naveli su da ćelije bez mitohondrijske DNK i dalje podliježu feroptozi, što je upućivalo na to da mitohondrije nisu neophodne. Kasniji radovi utvrdili su da uklanjanje mitohondrija ili blokiranje respiracije može suzbiti feroptozu uzrokovanu nedostatkom cisteina, ali ne i onu uzrokovanu direktnom inhibicijom GPX4. Oba rezultata mogu biti tačna ako doprinos mitohondrija zavisi od okidača, vrste ćelije i mjesta na kojem se odvija presudna peroksidacija.

Studija na kojoj se zasniva ovaj članak pristupila je tom sporu pomoću sonde specifične za određeni ćelijski odjeljak. MitoCLox je verzija indikatora lipidne peroksidacije usmjerena na mitohondrije: mijenja fluorescenciju kada naiđe na lipidne peroksilne radikale unutar mitohondrija. U fibroblastima tretiranim erastinom oksidacija mitohondrijske sonde pojavila se u još živim ćelijama prije smrti i nije bila ujednačena u cijeloj populaciji. Taj vremenski slijed je važan. Peroksidacija koja prethodi smrti mogući je uzrok. Peroksidacija izmjerena samo u mrtvim ćelijama predstavlja ostatke. Prateći vodič o testovima lipidne peroksidacije i tome šta svaka sonda pokazuje objašnjava zašto lokacija sonde određuje značenje signala.

Isti obrazac pojavio se u drugom modelu. Fibroblasti pacijenta s Leberovom nasljednom optičkom neuropatijom, koji nose mutaciju kompleksa I i imaju viši osnovni nivo oksidativnog stresa, umrli su feroptozom kada je glutation iscrpljen, dok su kontrolni fibroblasti bili otporni. Oksidacija mitohondrijske sonde ponovo je nastupila prva. Pojedinosti su navedene u studiji mitohondrijske lipidne peroksidacije u feroptozi na fibroblastima.

Šta je metilensko plavilo promijenilo u ovim eksperimentima

Metilensko plavilo je redoks prenosilac. Njegov oksidirani oblik prihvata elektrone iz reakcija povezanih s NADH na kompleksu I, a reducirani oblik predaje ih citohromu c, koji ih prenosi do kompleksa IV. Time nastaje djelimični obilazni put oko dijela lanca u kojem elektroni obično prelaze na kisik i stvaraju superoksid. Čitaoci koji žele potpun prikaz prijenosa trebaju početi od objašnjenja kako metilensko plavilo prenosi elektrone kroz mitohondrije.

U plućnim fibroblastima tretiranim erastinom metilensko plavilo pri koncentraciji od 250 nanomolara očuvalo je vijabilnost prema testu preživljavanja ćelija, kao i antioksidansi SkQ1 i MitoTEMPO usmjereni na mitohondrije. Kontrole određuju šta se može tvrditi. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol i deferoksamin također su pružili zaštitu, što potvrđuje da je smrt bila feroptotična. Analog SkQ1 bez antioksidativne grupe nije pružio zaštitu, što upućuje na redoks reakcije, a ne na nespecifično nakupljanje. Zaštita je slabila iznad približno 200 nanomolara SkQ1, što je u skladu s poznatim prooksidativnim djelovanjem kinonskih antioksidansa pri višim koncentracijama. Metilensko plavilo također ima ovo dvojako djelovanje zavisno od doze: u ovim kulturama pruža zaštitu pri niskim nanomolarnim koncentracijama, a pri višim koncentracijama ili jakom osvjetljenju može stvarati vodikov peroksid redoks ciklusima. Ovakav kontekst doze obrađen je u članku o reaktivnim vrstama kisika u mitohondrijama.

Eksperimenti s izoliranim mitohondrijama zatim su razdvojili izvore reaktivnih vrsta kisika (ROS). U prisustvu dvovalentnog željeza, supstrati koji dovode elektrone u kompleks I zajedno s rotenonom potaknuli su oksidaciju sonde. Rotenon blokira prijenos nizvodno od flavinskog mjesta, pa prenosioci uzvodno ostaju reducirani i elektroni s flavina okrenutog prema matriksu prelaze na kisik. Supstrati koji dovode elektrone u kompleks III zajedno s antimicinom A proizveli su obilje vodikovog peroksida, ali nisu pokrenuli lipidnu peroksidaciju. Isti ukupni signal ROS-a, druga lokacija, drugačiji ishod. SkQ1 i metilensko plavilo suzbijali su peroksidaciju potaknutu kompleksom I bez suzbijanja same proizvodnje vodikovog peroksida, što njihovo djelovanje smješta nakon nastanka ROS-a, u korak lipidne peroksidacije.

Eksperimenti s preopterećenjem željezom i trag koji daje lipofuscin

Druga studija ispitala je pitanje sa strane željeza. U kardiomiocitima H9c2 izloženim submilimolarnim koncentracijama amonijevog citrata trovalentnog željeza pojavili su se mitohondrijski ROS, mitohondrijska lipidna peroksidacija, zatim feroptoza, a potom i nakupljanje pigmenta sličnog lipofuscinu u roku od 24 sata. Lipofuscin je autofluorescentni ostatak oksidiranih lipida i proteina koji sadrži željezo i nakuplja se s godinama. Njegova brza pojava ovdje povezuje akutnu peroksidaciju potaknutu željezom s klasičnim markerom starenja. Metilensko plavilo u nanomolarnim koncentracijama i SkQ1 spriječili su peroksidaciju, smrt i nakupljanje pigmenta. Izolirane srčane mitohondrije potvrdile su obrazac: rotenon zajedno s dvovalentnim željezom potaknuo je peroksidaciju i signal sličan pigmentnom, a oba sredstva su to blokirala. Cijeli slijed opisan je u studiji preopterećenja željezom u kardiomiocitima H9c2. Dio koji se odnosi na pigment povezan je s temom lipofuscina i markera ćelijskog starenja.

Šta testovi preživljavanja ćelija ne pokazuju

Test vijabilnosti poput CellTiterBlue pokazuje koliko ćelija u posudi ostaje metabolički aktivno nakon izlaganja okidaču i sredstvu koje se ispituje kao moguća zaštita. To je provjera mehanizma u definiranom sistemu. Nije ishod liječenja. Nijedan od ovih eksperimenata nije uključivao davanje doze pacijentu, mjerenje ishoda bolesti ili utvrđivanje terapijskog raspona u organizmu.

Četiri ograničenja treba jasno navesti. Prvo, raspon vrsta ćelija je uzak: transformirani plućni fibroblasti, primarni kožni fibroblasti koji uključuju jednu liniju s mitohondrijskom bolešću i linija kardiomiocita štakora, uz izolirane mitohondrije srca štakora. Osjetljivost se razlikovala među linijama, a linija LHON namjerno je odabrana zbog neuobičajene ranjivosti. Drugo, okidači su laboratorijski ekstremi: potpuna blokada transporta ili sinteze te opterećenja željezom kojima nijedno tkivo ne bi bilo akutno izloženo. Treće, koncentracija se ne može preračunati u dozu jednostavnim množenjem. Nanomolarna koncentracija u mediju za kulturu nije ljudska doza, a između posude i čovjeka stoje raspodjela metilenskog plavila, njegova redukcija u bezbojni oblik u krvi i tkivu, izloženost svjetlosti i membranski potencijal. Četvrto, sonde izvještavaju o vlastitom odjeljku. Oksidacija MitoCLox pokazuje da su nastali mitohondrijski lipidni radikali; ne pokazuje da je pucanje plazmatske membrane, vjerovatni završni događaj, direktno spriječeno, umjesto da je izbjegnuto djelovanjem u ranijem koraku.

Stoga je opravdana tvrdnja sljedeća: u ovim modelima ROS porijeklom iz kompleksa I zajedno sa željezom pokreću mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju koja prethodi feroptozi, a metilensko plavilo pri niskim koncentracijama prekida taj dio procesa. Za sve što izlazi izvan tog dijela potrebni su drugačiji eksperimenti na životinjama, a zatim na ljudima.