Zašto se apsorpcija metilenskog plavila mijenja s koncentracijom

Uzmite jednu bocu matičnog rastvora metilenskog plavila i napunite dvije čaše. Prvu napunite matičnim rastvorom, a drugu desetostruko razrijeđenim rastvorom. Druga čaša je bljeđa, kao što se i očekuje. Pogledajte pažljivo i primijetit ćete još jednu promjenu. Nijansa se promijenila. Jedan rastvor naginje čistoj nebeskoplavoj boji, a drugi plavoj s ljubičastim tonom. Razrjeđivanje nije samo smanjilo intenzitet boje. Promijenilo je hemijsku vrstu koja apsorbira najveći dio svjetlosti.

Objašnjenje ove promjene je jednostavno. Rastvoreno metilensko plavilo nije samo jedna hemijska vrsta. Pojedinačni kation boje, koji se naziva monomer, može se složiti licem uz lice s drugim kationom i formirati dimer, a dimeri mogu prerasti u veće agregate. Svaki oblik ima vlastiti apsorpcijski spektar. Spektrofotometar prikazuje zbir doprinosa smjese prisutne u toj kiveti, pod tim uslovima. Promijenite smjesu i spektar će se promijeniti, čak i kada ukupni sadržaj boje prati tačan omjer razrjeđivanja.

Monomer i dimer različito apsorbiraju svjetlost

Zamislite monomer kao ravnu kartu s pozitivnim nabojem raspoređenim po njegovom prstenastom sistemu. Dvije takve karte mogu ležati licem uz lice. Pozitivni naboji se odbijaju, ali se ravne aromatske površine privlače interakcijama slaganja, dok okolna voda i kontraioni zasjenjuju to odbijanje. Rezultat je vezani par sa zajedničkim elektronskim stanjima. Njegovi dozvoljeni prijelazi imaju višu energiju od prijelaza monomera, pa se traka dimera pojavljuje na kraćoj talasnoj dužini od trake monomera, dok veći agregati dodatno doprinose na strani prema plavom dijelu spektra u obliku ramena.

Pri vrlo niskoj koncentraciji u čistoj vodi prevladavaju monomeri, pa prevladava i traka na dužoj talasnoj dužini. Kako ukupna koncentracija raste, udio uparenog oblika postaje sve veći, a traka na kraćoj talasnoj dužini raste u odnosu na prvu. Omjer dvije trake zato pokazuje sastav smjese, a ne neposredno ukupnu koncentraciju. Očitanje na jednoj talasnoj dužini ne može razdvojiti ta dva oblika bez pretpostavke o tome koji je oblik prisutan.

Zato se referentni spektri uvijek moraju navoditi zajedno s uslovima mjerenja. Spektralni referentni podaci za metilensko plavilo tabelarno prikazuju položaje traka zajedno s rastvaračem, prisutnim solima, pH vrijednošću, temperaturom i rasponom koncentracija pri kojima su dobijeni. Ako navedete maksimum bez tih uslova, broj nije dovoljno određen. Dvije laboratorije mogu navesti različite spektre iste boje i obje biti u pravu jer su mjerile različite smjese.

Šta pomjera ravnotežu

Koncentracija je glavni faktor. Za nastanak dimera potrebno je da se dva monomera susretnu, pa njegov udio raste brže od linearne zavisnosti od ukupne koncentracije boje. Objavljene konstante dimerizacije u vodi pri temperaturama bliskim sobnoj iznose nekoliko hiljada po molaru, pa udio dimera naglo raste u mikromolarnom rasponu. Opsežno globalno prilagođavanje modela podacima, koje je obuhvatilo koncentracije boje od mikromolarnih do milimolarnih, utvrdilo je doprinos tetramera različit od nule već ispod 34 mikromola po litru. To upozorava da pri koncentracijama od nekoliko desetina mikromola po litru ne treba bezrezervno vjerovati modelu sa strogo dvije hemijske vrste. Tačni udjeli zavise od medija, zbog čega ovaj članak navodi smjerove promjena umjesto univerzalne tabele za preračunavanje.

So je drugi faktor. Rastvoreni ioni zasjenjuju odbijanje između dva kationa, pa dodani natrijev hlorid i slični elektroliti pomjeraju smjesu prema dimerima i agregatima pri istoj koncentraciji boje. Ovaj efekat je vidljiv u istraživanjima agregacije metilenskog plavila u slanim i vodenim medijima, u kojima je boja u koncentracijama od oko 1 mikromola po litru do 3.4 milimola po litru mjerena pri koncentracijama natrijevog hlorida od 0 do 0.15 mola po litru. U tom prilagođavanju modela udio tetramera dostigao je oko 0.93 pri istovremeno visokoj koncentraciji boje i soli. Spektar snimljen u vodi i spektar snimljen u fiziološkom rastvoru zato nisu međusobno zamjenjivi standardi.

Temperatura djeluje u suprotnom smjeru. Slaganje oslobađa vezanu vodu, a termičko kretanje mu se suprotstavlja, pa zagrijavanje rastvora obično dovodi do disocijacije dijela dimera nazad u monomere, dok hlađenje pogoduje udruživanju. Entalpija disocijacije dobijena prilagođavanjem modela je negativna, oko minus 30 kilodžula po molu u rasponu od 282 do 333 kelvina, što potvrđuje egzotermno udruživanje. Hladan uzorak mjeren neposredno nakon vađenja iz frižidera može djelovati više agregirano nego isti uzorak mjeren nakon uspostavljanja ravnoteže na sobnoj temperaturi.

Rastvarač određuje polazno stanje. Voda, zbog snažnog hidrofobnog efekta, potiče slaganje ravnih kationa boje. Alkoholi poput etanola i metanola bolje solvatiraju prstenove i razgrađuju agregate, pa pri istoj koncentraciji boje u etanolu ima više monomera nego u vodi. Aprotični korastvarači djeluju na isti način: u smjesama vode i DMSO-a pri 293 kelvina dodani DMSO suzbijao je dimerizaciju, što upućuje na strukturu vode kao pokretač slaganja. S površinski aktivnim tvarima potreban je oprez jer mogu djelovati u oba smjera. Iznad njihove kritične micelarne koncentracije micele mogu pojedinačno solubilizirati monomere i vratiti spektar sličan spektru monomera. Ispod te granice površinski aktivna tvar suprotnog naboja može, naprotiv, poticati slaganje: pri koncentraciji boje od 100 mikromola po litru polimerizacija potaknuta SDS-om dostigla je maksimum blizu 4 milimola SDS-a po litru, približno na polovini koncentracije potrebne za nastanak micela, prije preraspodjele pri višim koncentracijama površinski aktivne tvari. Rad o utjecaju rastvarača i organiziranih medija na spektre metilenskog plavila pokazuje koliko snažno neposredno molekularno okruženje, a ne samo ukupna koncentracija, određuje opažene trake.

pH je važan uglavnom pri krajnjim vrijednostima. U približno neutralnom rasponu koji se koristi u većini laboratorijskog rada metilensko plavilo ostaje u svom poznatom plavom kationskom obliku, a agregacija ima dominantan utjecaj na spektar. Jaka kiselina ili baza, redoks reakcije koje stvaraju bezbojni leuko oblik ili vezivanje za proteine i čestice uvode dodatna stanja izvan para monomer-dimer. Kada se spektar promijeni nakon dodavanja pufera, provjerite sastav pufera zbog soli i komponenti koje mogu vezivati boju prije nego što sve pripišete samo pH vrijednosti. Referentni pregled hemije i protonacije razmatra ova pitanja hemijskog identiteta odvojeno od pitanja agregacije obrađenog ovdje.

Zašto se prava linija Beer-Lambertovog zakona zakrivljuje

Beer-Lambertova relacija kaže da je apsorbancija jednaka proizvodu apsorptivnosti, koncentracije i dužine optičkog puta. To je zakon koji se zasniva na brojanju. Pretpostavlja da objekti koji se broje ostaju isti dok se njihov broj mijenja: jedna apsorbirajuća hemijska vrsta, nepromjenjiv spektar, bez hemijskih promjena s koncentracijom, monohromatska mjerna svjetlost, bez raspršenja ili ponovne emisije te svjetlost koja zaista prolazi navedenim putem.

Agregacija narušava prvu pretpostavku. Formalno, ukupna apsorbancija ostaje zbir doprinosa hemijskih vrsta: dužina optičkog puta pomnožena s apsorptivnošću svake vrste i njenom koncentracijom. Svaka hemijska vrsta slijedi zakon. Smjesa ga ne slijedi jer su koncentracije pojedinačnih vrsta nelinearne funkcije ukupne koncentracije boje. Kalibracijska kriva apsorbancije na traci monomera u odnosu na ukupnu koncentraciju boje zato počinje pravolinijski pri velikom razrjeđenju, a zatim se zakrivljuje naniže kako koncentracija raste jer svaki dodatni porast donosi proporcionalno manje monomera. Kriva očitana na traci dimera zakrivljuje se u suprotnom smjeru. Istraživanja agregacije upravo ovaj mehanizam prepoznaju kao izvor opaženih odstupanja od Lambert-Beerovog zakona. Uobičajena greška je prilagoditi pravu liniju zakrivljenom dijelu i zatim je ekstrapolirati. Ta linija vrijedi samo unutar raspona i matriksa u kojima je izrađena.

Razrjeđivanje stvara sličnu zamku. Razrjeđivanjem koncentriranog matičnog rastvora do mjernog raspona instrumenta ne zadržava se omjer hemijskih vrsta. Razrijeđeni rastvor u kiveti ponovo uspostavlja ravnotežu prema monomeru, pa njegov spektar tačno opisuje razrijeđeni uzorak, ali netačno opisuje matični rastvor. Obrnuti proračun spektra matičnog rastvora povećavanjem apsorbancija vraća procjenu ukupnog sadržaja samo ako kalibracija već uzima u obzir tu promjenu. Nikada ne vraća izvorni oblik traka. Svako ko poredi spektar koncentrata s razrijeđenim referentnim rastvorom poredi dvije različite smjese.

Dužina optičkog puta je dio rezultata

Apsorbancija se povećava proporcionalno udaljenosti koju svjetlost pređe kroz uzorak. Kiveta od 10 mm daje deset puta veću apsorbanciju od kivete od 1 mm koja sadrži isti rastvor. Takvo skaliranje je tačno samo za isti rastvor, a zbog agregacije taj uslov je presudan.

U praksi je dužina optičkog puta sredstvo za zadržavanje mjerenja unutar važećeg raspona. Dug put daje osjetljivost pri mjerenju razrijeđenih rastvora u kojima prevladavaju monomeri. Kratak put omogućava mjerenje koncentriranog uzorka unutar raspona instrumenta bez velikog razrjeđivanja koje bi ponovo uspostavilo ravnotežu. U istraživanju agregacije iz kojeg potječu prethodno navedene vrijednosti primijenjen je upravo taj pristup: kivete od 1 centimetra za koncentracije boje od 1.1 do 34 mikromola po litru i kivete od 0.01 centimetra za koncentracije od 94 mikromola po litru do 3.4 milimola po litru. Postolja za mjerenje mikrovolumena i čitači mikrotitarskih ploča uvode vlastitu geometriju, s kratkim i ponekad promjenjivim optičkim putevima te površinama na koje se kationska boja može adsorbirati. Uz broj navedite i dužinu puta, kao što spektralni referentni podaci navode rastvarač i so. Apsorbancija bez dužine optičkog puta nije rezultat. To je glasina.

Iz ovog mehanizma proizlaze pravila mjerenja. Prije očitanja dovedite uzorke u ravnotežu na istoj temperaturi. Koristite isti tip i orijentaciju kivete, odgovarajuće slijepe probe koje sadrže iste soli i pufer te čisto laboratorijsko staklo jer se metilensko plavilo adsorbira na staklo i plastiku, a obojena kiveta zadržava trag prethodnog koncentriranog uzorka. Kada je kinetika agregacije važna, očitajte uzorke ubrzo nakon pripreme i izradite svaku kalibracijsku krivu u istom matriksu i pri istoj dužini optičkog puta kao za nepoznate uzorke. Pri vizuelnim provjerama imajte na umu da je oko loš spektrometar. Pitanje može li se bojom rastvora utvrditi čistoća zasebno je pitanje na koje je odgovor negativan, a promjene nijanse usljed agregacije jedan su od razloga.

Dijagram koji treba držati pored instrumenta

Slika u nastavku sažima članak u jedan referentni prikaz za laboratorijski sto. Tri rastvora sadrže istu boju, ali se razlikuju po ukupnoj koncentraciji i prisutnim solima. Njihovi shematski spektri pokazuju kako s povećanjem slaganja opada udio trake monomera na dužoj talasnoj dužini, a raste udio trake dimera na kraćoj talasnoj dužini. Uslovi su navedeni na slici jer se bez njih krive ne mogu ponovo koristiti. Za izmjerene položaje traka pod navedenim uslovima koristite spektralne referentne podatke. Za objašnjenje kako boja ulazi u ćelije nakon što se nađe u rastvoru pogledajte ulazak u ćelije putem redukcije i raspodjele između faza. Za objašnjenje kako doza svjetlosti i geometrija dodatno oblikuju rezultate fotohemijskih mjerenja pogledajte izlaganje svjetlosti i geometriju mjerenja.

Pravilo koje treba zapamtiti ima dva dijela. Spektar identificira smjesu prisutnu u kiveti pod navedenim uslovima. Samo kalibracija izrađena pod tim istim uslovima pretvara apsorbanciju u ukupnu koncentraciju.