Članak
Metilensko plavilo kao antioksidans i prooksidans: šta mijenja ishod?
Pretpostavimo da dvije laboratorije ispituju istu plavu boju i prijave suprotne rezultate. U prvoj izolirane moždane mitohondrije bolje respiriraju i stvaraju više ATP-a. U drugoj isti preparat oslobađa znatno više vodikovog peroksida. Oba izvještaja su tačna. Opisuju isti ciklus posmatran s dva kraja, a zabuna počinje kada čitaoci jedan kraj shvate kao cijelu priču.
Greška je pitati koja oznaka odgovara molekuli. Metilensko plavilo je posrednik u prijenosu elektrona, što mapa njegovih ciljnih mjesta u ćelijskoj biologiji prikazuje u širem kontekstu. Oksidirana boja prima elektrone i postaje bezbojni leucoMB. LeucoMB predaje te elektrone dalje i ponovo postaje plav. Ono što opažate zavisi od toga ko donira elektrone, ko ih prima i može li sistem ukloniti vodikov peroksid nastao usput. Pravo pitanje nikada nije da li je boja antioksidans. Pitanje je šta uslovi omogućavaju tom posredniku da radi.
Ciklus koji stvara oba lica
U mraku je osnovni ciklus kratak. NADH, NADPH ili nosači elektrona u respiratornom lancu reduciraju boju. Reducirana boja zatim ima nekoliko konkurentskih puteva. Može predati elektrone citohromu c i podržati tok koji zaobilazi oštećeni kompleks, zbog čega se respiracija i membranski potencijal djelimično oporavljaju pri blokadi kompleksa I ili III. Ili može predati elektrone direktno kisiku, čime se obnavlja plavi oblik i stvara vodikov peroksid. Budući da se boja obnavlja, mala količina može mnogo puta ponoviti ovaj ciklus, neprestano trošeći redukcijske ekvivalente i stvarajući peroksid.
Dvije dodatne grane potpuno mijenjaju hemiju. Slobodni bakar ili željezo pretvaraju taj peroksid, koji može difundirati, u znatno razornije lokalne oksidanse kroz reakcije Fentonovog tipa. Crvena svjetlost otvara zasebnu fotohemijsku granu u kojoj pobuđena boja prenosi energiju na kisik i stvara singletni kisik, vrstu detaljno obrađenu u objašnjenju fotohemije tipa I i tipa II. Redoks ciklusi u mraku, oštećenja pojačana metalima i fotodinamička oštećenja tri su različita mehanizma kojima je zajednička samo početna molekula.
Matrica uslova i ishoda
Tabela u nastavku vrijedi sačuvati. Svaki red prikazuje jednu varijablu, smjer u kojem ona djeluje i eksperiment koji to potkrepljuje. Pozitivno znači zaštitni učinak ili poboljšan izmjereni pokazatelj. Nepovoljno znači više oksidansa, veće iscrpljivanje ili više oštećenja.
| Uslov | Smjer ishoda | Šta je eksperiment pokazao |
|---|---|---|
| Niska koncentracija, 0.1 do 1 uM, izolirane mitohondrije | Pozitivna bioenergetika uz više peroksida | 0.1 uM poboljšalo je potrošnju kisika u srčanim mitohondrijama zdravih štakora i štakora s dijabetesom; 100 nM do 1 uM djelimično je obnovilo ATP, membranski potencijal i preuzimanje kalcija u blokiranim moždanim mitohondrijama, dok je oslobađanje peroksida poraslo u svim uslovima |
| Viša koncentracija, iznad 5 uM, ćelije bez glukoze | Nepovoljan signal oksidansa | Endotelne ćelije oksidirale su opću sondu za ROS i gubile reducirani glutation iznad 5 uM kada glukoza nije bila prisutna; dodavanje glukoze spriječilo je oboje |
| Supstrati kompleksa I (glutamat i malat) | Više peroksida | Istraživanja i moždanih i srčanih mitohondrija utvrdila su povećano oslobađanje peroksida uz supstrate povezane s NADH |
| Sukcinat i rotenon, srčane mitohondrije, 0.1 uM | Manje peroksida u tom protokolu | Jedini jasno antioksidativni rezultat mjerenja peroksida u ovom skupu; imajte na umu da je protokol uključivao rotenon i drugo tkivo, pa ga sam supstrat ne objašnjava |
| Crvena svjetlost, 20 uM uz 630 nm | Nepovoljno oštećenje DNK | Bez značajnih lezija mitohondrijske DNK u mraku pri 20 uM; ista koncentracija uz crvenu svjetlost oštetila je svaki ispitani fragment |
| Vrlo visoka koncentracija u mraku, 100 uM | Nepovoljno selektivno oštećenje DNK | Selektivne lezije mitohondrijske DNK na sekvencama bogatim purinima, kvalitativni pomak u odnosu na nanomolarni signal peroksida |
| Bakar ili željezo uz NADH, DNK u sistemu bez ćelija | Nepovoljne oksidativne lezije | Bakar je usmjerio oštećenje na sekvencu p53 sklonu mutacijama; željezo-EDTA izazvalo je široko rasprostranjena oštećenja; katalaza i kelatori metala blokirali su odgovarajuće puteve; količina oksidiranog gvanina se povećala |
| Glukoza prisutna, intaktne ćelije | Zaštitno ublažavanje uprkos bržem ciklusu | Glukoza je povećala redukciju boje, ali smanjila ukupni stres, što je u skladu s opskrbom NADPH-om iz pentoza-fosfatnog puta za obnavljanje antioksidansa |
| Ćelije obogaćene askorbatom | Mješovito: askorbat se troši, signal sonde se ublažava | Boja je postepeno oksidirala unutarćelijski askorbat čak i uz prisutnu glukozu, dok je djelimično suzbijala oksidaciju sonde; zalihe odbrambenih molekula platile su cijenu |
| Životinje prethodno tretirane rotenonom, boja data prva | Pozitivan ishod u tkivu | Prethodni tretman bojom smanjio je lezije mitohondrijske DNK izazvane rotenonom u srednjem mozgu miševa uprkos povećanju peroksida u izoliranim mitohondrijama |
Suština je u obrascu koji se vidi kroz redove. Proizvodnja peroksida i biološka zaštita odvojene su ose. Tretman istovremeno može imati nepovoljan rezultat na prvoj i pozitivan na drugoj.
Zašto ista doza daje različite odgovore
Koncentracija određuje kapacitet prijenosa elektrona, a ne ishod. Oslobađanje peroksida iz moždanih mitohondrija mjerljivo je raslo od 50 nM naviše u istraživanju intaktnih moždanih mitohondrija, dok je za jasno oštećenje mitohondrijske DNK bilo potrebno 100 uM u mraku. To je približno dvije hiljade puta veća koncentracija između prvog signala i genotoksičnosti, ali nije sigurnosna margina. Krajnji pokazatelji, odjeljci i vremena izlaganja razlikuju se, pa brojevi označavaju različite pojave, a ne tačke na jednoj krivulji. Rasprava o odnosu doze i odgovora smješta ovakav jaz između slabog signala i velikog oštećenja u širi kontekst hormeze.
Supstrat određuje gdje elektroni ulaze. Goriva povezana s NADH daju boji obilje redukcijskih ekvivalenata i za koristan obilazni put i za rasipnu reakciju s kisikom. Često citirani sažetak prema kojem sukcinat čini boju antioksidansom, a glutamat prooksidansom previše iščitava iz podataka, jer je uslov za mjerenje peroksida uz sukcinat u istraživanju srca sadržavao i rotenon te koristio drugačije tkivo i dozu nego istraživanje mozga koje je utvrdilo povećan peroksid uz svaki supstrat i u svakom stanju respiracije.
Svjetlost mijenja mehanizam, a ne samo intenzitet. Najjasniji kontrast u ovom skupu jeste 20 uM u mraku bez ikakvog mjerljivog djelovanja na fragmente mitohondrijske DNK nasuprot 20 uM pod crvenom svjetlošću koja oštećuje sve njih. Ko poredi osvijetljeni eksperiment s onim u mraku, poredi fotohemiju s redoks ciklusima.
Metali pretvaraju oksidans. Bez metala ciklus boje u mraku stvara peroksid, molekulu koja može difundirati i koju ćelije koriste i kao signal. Uz dostupan bakar ili željezo, boja reducirana NADH-om podstiče redukciju metala, a reducirani metal aktivira peroksid u vrste hidroksilnog tipa ili vrste bakar-peroksida uz samu DNK. Tako je istraživanje s NADH i metalnim ionima u sistemu bez ćelija iz iste početne boje proizvelo i oštećenja selektivna za mjesta sklona mutacijama i široko rasprostranjena oštećenja DNK. Način na koji odjeljak upravlja metalima, a ne sama boja, određuje da li je ova grana važna.
Stanje opskrbe gorivom određuje može li ćelija platiti cijenu. U endotelnim ćelijama izloženim boji u koncentraciji od 2 do 20 uM, uklanjanje glukoze razotkrilo je oksidativni trošak, dok ga je opskrba glukozom izbrisala, iako je glukoza također ubrzala redukciju boje. Brži ciklusi uz opskrbljenu odbranu bolji su od sporijih ciklusa uz iscrpljenu odbranu. Svaku tvrdnju o oksidansima koja izostavlja stanje glukoze ili NADPH smatrajte nepotpunom.
Tkivo određuje raspoloživu opremu. Endotelne ćelije obnavljaju NADPH kroz metabolizam glukoze i imaju citosolne zalihe antioksidansa. Izolirane mitohondrije nemaju ništa od toga. Pročišćena DNK nema čak ni mehanizme popravke. Rezultat u jednom preparatu malo govori o ostalima, zbog čega će planirani tekst o odgovorima specifičnim za tkivo morati jasno razdvojiti ove sisteme.
Direktno mjerenje nije naknadna odbrana
Mnogi tekstovi spajaju dva nivoa koja eksperimenti drže odvojenim. Jedan nivo pita koliko se oksidansa pojavilo. Drugi pita kako je ćelija odgovorila.
Testovi peroksida tipa Amplex najbliži su prvom nivou, a čak i oni prikazuju neto tok, odnosno proizvodnju umanjenu za razgradnju i izvoz. Istraživanje moždanih mitohondrija utvrdilo je promjene na obje strane: stvaralo se više peroksida, a dodani bolus peroksida uklanjao se sporije. Dalje nizvodno nalaze se oksidacija glutationa, potrošnja askorbata, oksidirani gvanin i lezije DNK koje blokiraju polimerazu. Svaki korak dodaje biološke procese između oksidansa i izmjerenog pokazatelja.
Antioksidativni enzimi čiju ekspresiju pokreće Nrf2 i mitohondrijska biogeneza nalaze se na drugom nivou. To su adaptivni programi koje može pokrenuti blagi puls peroksida, a autori istraživanja zaštite moždanih mitohondrija predlažu upravo taj blagi stres kao okidač, uz napomenu da se uzročni lanac preko Nrf2 oslanja na prethodna istraživanja, a ne na njihov vlastiti potpuni dokaz. Zaštita koja nastupi satima kasnije putem novih proteina ne znači da je početna hemija bila antioksidativna. Znači da je mali prooksidativni događaj omogućio veću odbranu. Smjernice za tumačenje takvih tvrdnji, uključujući ograničenja testova i razlike među preparatima, tema su vodiča za čitanje istraživanja o metilenskom plavilu.
Zašto se testovi međusobno ne slažu
Opća sonda poput dihidrofluoresceina pokazuje oksidaciju sonde kroz širok raspon reakcija, a ne koncentraciju peroksida. Zavisi od hemije peroksidaza i hema i može propustiti porast peroksida koji kalibrirani Amplex test registrira. Istraživanje moždanih mitohondrija pokazalo je naglo povećanje peroksida bez odgovarajućeg signala superoksida, što upozorava da ne treba citirati nijednu antioksidativnu tvrdnju zasnovanu samo na jednoj boji. Optičko preklapanje opravdano je pitanje za kontrolu jer boja apsorbira vidljivu svjetlost blizu uobičajenih pobudnih i emisionih opsega, ali pažljivo provedeno istraživanje izvršilo je kalibraciju prema poznatim količinama peroksida, smanjilo izlaganje pobudnoj svjetlosti uz malu promjenu signala i potvrdilo sporije uklanjanje peroksida zasebnom elektrodom. Interferenciju treba provjeriti kontrolnim mjerenjem, a ne koristiti kao razlog za automatsko odbacivanje.
Rezultat vezan za kalcij pokazuje istu potrebu za preciznošću. Akutno izlaganje boji nije promijenilo ukupno opterećenje kalcijem prije prijelaza permeabilnosti u istraživanju srca, ali je poboljšalo brzinu preuzimanja kalcija u blokiranim moždanim mitohondrijama u istraživanju srčanih mitohondrija usmjerenom na dijabetes. Različiti krajnji pokazatelji, različiti sistemi, bez proturječja.
Kontrolna lista prije nego što povjerujete zaključku
Svaki zaključak o antioksidativnom ili prooksidativnom djelovanju shvatite kao izvještaj o određenom sistemu i postavite pet pitanja. Pri kojoj koncentraciji i u kojem odjeljku. S kojim donorom elektrona i kojim konkurentskim akceptorom. Na svjetlosti ili u mraku, te pri kojoj talasnoj dužini i dozi. Uz koje dostupne metale i kakvu opskrbu gorivom i zalihama antioksidansa. I kojim testom, koji mjeri tok oksidansa, oštećenje ili adaptivni odgovor. Promijenite bilo koji odgovor i ista molekula može se u matrici pomjeriti od zaštitne do štetne bez ikakvog paradoksa.