Članak
Alternative metilenskom plavilu za mikroskopiju: birajte prema zadatku
Za jednostavan bakterijski razmaz, kristal violet može zamijeniti metilensko plavilo kada je cilj vidjeti oblik ćelija. Za žive ćelije bolja alternativa može biti fazni kontrast bez ikakvog bojenja. Izbor zavisi od opažanja koje trebate izvršiti.
Pretpostavimo da dvije osobe ispituju istu bakterijsku kulturu. Jedna želi razlikovati štapićaste od okruglih ćelija. Druga želi utvrditi da li je tretman usmrtio bakterije. Boja koja prvoj osobi daje jasnu sliku drugoj možda neće dati upotrebljiv odgovor.
Prije nego što izaberete zamjenu, dovršite ovu rečenicu: „Trebam posmatrati ___ u ___, a ćelije moraju / ne moraju ostati žive.” Ta rečenica definiše zadatak koji boja mora obaviti.
Počnite od uzorka i pitanja
Prvo odlučite da li ćelije moraju ostati žive, a zatim odredite karakteristiku koju trebate posmatrati:
- Ćelije moraju ostati žive: za kretanje ili oblik razmotrite fazni kontrast bez bojenja ili DIC; za nuklearnu DNK razmotrite Hoechst 33342 uz fluorescentnu mikroskopiju; za integritet membrane izaberite validirani test kao što je SYTO 9 s propidijum-jodidom.
- Ćelije ne moraju ostati žive: za bakterijsku morfologiju razmotrite jednostavno bojenje kristal violetom ili negativno bojenje nigrozinom; za Gram reakciju koristite kompletnu metodu bojenja po Gramu; za nuklearnu DNK u fiksiranim ćelijama razmotrite DAPI fluorescentno bojenje.
Koristite ovu tabelu za poređenje ograničenja svake grane. Ovo su izbori metoda, a ne upute za zamjenu bočica unutar postojećeg protokola.
| Šta trebate posmatrati | Uzorak i oprema | Moguća alternativa | Glavno ograničenje |
|---|---|---|---|
| Oblik i raspored bakterija | Pripremljeni bakterijski razmaz; svijetlo polje | Jednostavno bojenje kristal violetom | Prikazuje morfologiju; ne utvrđuje Gram reakciju ni vijabilnost. |
| Obrisi ćelija na tamnoj pozadini | Bakteriološki preparat; svijetlo polje | Negativno bojenje nigrozinom | Priprema i formulacija su važne; neobojena ćelija nije nužno živa. |
| Gram reakcija | Pripremljeni bakterijski razmaz; svijetlo polje | Kompletna metoda bojenja po Gramu | Zahtijeva puni slijed reagensa i kontrole. |
| Kretanje ili promjene u živim ćelijama | Kompatibilan vlažni preparat; fazni kontrast ili DIC | Bez bojenja | Zahtijeva odgovarajuću optiku; kontrast ne identificira molekulu. |
| Nuklearna DNK | Fiksirane ćelije; fluorescencija | DAPI | Zahtijeva kompatibilne ekscitacijske i emisijske filtere. |
| Nuklearna DNK u živim ćelijama | Žive ćelije; fluorescencija | Hoechst 33342 | Ulazak u ćeliju ne potvrđuje da su uslovi snimanja bezopasni. |
| Integritet bakterijske membrane | Nefiksirane bakterije; fluorescencija | SYTO 9 s propidijum-jodidom | Bojenje membrane je indirektna mjera vijabilnosti. |
Kod jednostavnog razmaza pažljivo zamijenite metodu
Kristal violet je praktičan izbor kada je zadatak dobiti jednobojni prikaz bakterijske morfologije. FDA-ov Bacteriological Analytical Manual navodi dvije formulacije kristal violeta pogodne za jednostavno bojenje. Koristite dokumentovanu formulaciju i pripadajući način pripreme; sam naziv boje ne određuje radni reagens.
Kristal violet se koristi i u bojenju po Gramu, ali to ne znači da je jednostavno bojenje kristal violetom isto što i bojenje po Gramu. U ASM protokolu za bojenje po Gramu, diferencijalni rezultat zavisi od kristal violeta, joda, obezbojavanja i kontrastnog bojenja koji djeluju u slijedu. Izostavljanje tih koraka mijenja ono što se na osnovu slike može utvrditi. Za tu razliku pogledajte jednostavno bojenje naspram bojenja po Gramu.
Nigrozin pruža drugačiji način prikazivanja obrisa: zatamnjuje pozadinu, dok bakterijske ćelije ostaju relativno svijetle. U Merckovim uputama za nigrozin nalazi se važan detalj koji opšti spisak zamjena može previdjeti. Njihova navedena radna formulacija sadrži formaldehid. Zbog toga se kompatibilnost sa živim ćelijama ne može zaključiti samo iz izraza „negativno bojenje”, iako same ćelije izgledaju neobojeno. Provjerite kompletnu formulaciju i pripremu uzorka.
Za žive uzorke razmotrite promjenu optike
Ako želite posmatrati kako se ćelije kreću ili dijele, dodavanje druge boje može zakomplikovati opažanje. Kako Nikon objašnjava u svom vodiču o kontrastu u prozirnim uzorcima, fazni kontrast i diferencijalni interferencijski kontrast, odnosno DIC, čine uzorke vidljivim zahvaljujući razlikama u njihovim optičkim svojstvima. Mogu prikazati žive, neobojene ćelije ako mikroskop ima potrebne komponente.
Ovaj izbor zadržava preparat neobojenim, ali mijenja dostupne informacije. Možete pratiti granicu ili kretanje bez saznanja koja je molekula proizvela kontrast. Ako je pitanje lokalizacija molekula, umjesto toga izaberite odgovarajuću metodu označavanja.
Za nuklearnu DNK, Invitrogenovo poređenje DAPI i Hoechst boja razlikuje uobičajenu upotrebu DAPI-ja s fiksiranim ćelijama od Hoechst 33342, koji lakše prolazi kroz ćelijsku membranu i preferira se za označavanje živih ćelija. Oba zahtijevaju fluorescentnu opremu. Nijedan nije direktna zamjena za obojenu preparaciju u svijetlom polju.
Izlaganje boji i osvjetljenje tretirajte kao eksperimentalne uslove. Uporedite obojene i neobojene preparate kada je ponašanje ćelija ono što mjerite.
Crvena ćelija nije automatski mrtva ćelija
SYTO 9 i propidijum-jodid često se koriste zajedno za procjenu integriteta bakterijske membrane. BacLight priručnik povezuje neoštećene membrane sa zelenim bojenjem, a oštećene membrane sa crvenim bojenjem. Takvo tumačenje treba validirati za konkretni uzorak.
Studija Rosenberga i saradnika iz 2019. godine pokazuje problem. U 24-satnim biofilmovima E. coli na staklu u fosfatnom puferiranom fiziološkom rastvoru, oko 96% ćelija izgledalo je pozitivno na propidijum-jodid in situ. Ipak, autori su procijenili da je 82% bilo sposobno za kultivaciju nakon prikupljanja. Konfokalne slike pokazale su ćelije sa zelenom unutrašnjošću ispod crveno obojenog materijala, što je ukazivalo na ekstracelularne nukleinske kiseline kao izvor obmanjujućeg signala.
Ti procenti opisuju različita mjerenja na preparatima iz studije, a ne univerzalni korekcijski faktor. Korisna pouka je provjeriti šta je proizvelo signal. U biofilmu boja za nukleinske kiseline može detektovati materijal izvan ćelija, kao i unutar oštećenih ćelija. Za zaključak o vijabilnosti istraživači preporučuju komplementarna mjerenja, kao što su kultivacija ili metabolička aktivnost, uz napomenu da svako od njih ima ograničenja.
Provjerite šta alternativa zaista sadrži
Alternativna metoda bojenja i dalje može sadržavati metilensko plavilo. Giemsa je primjer: Merck svoj proizvod opisuje kao rastvor azure-eozin-metilensko-plavilo, namijenjen, između ostalog, za razmaze krvi i koštane srži. To može biti drugačija metoda za drugačiji uzorak, ali ne ispunjava zahtjev za isključivanje metilenskog plavila.
Ako je isključivanje određenog spoja dio eksperimenta, provjerite identitet reagensa i formulaciju prije poređenja slika. Vodič o methyl blue, methylene blue i bojama sa sličnim nazivima objašnjava razlike u nazivima.
Provjerite zamjenu prije korištenja rezultata
Za novu metodu napravite malo poređenje koristeći reprezentativne uzorke i odgovarajuću kontrolu. Postavke mikroskopa držite uporedivim gdje god je to moguće. Zabilježite formulaciju reagensa, pripremu uzorka, izlaganje i uslove snimanja kako bi se moglo istražiti zašto neka slika izgleda bolje, umjesto da se samo preferira.
Uspjeh procjenjujte prema prvobitnom pitanju. Za morfologiju procijenite da li se granice ćelija i njihov raspored i dalje mogu jasno tumačiti. Za označavanje jedra procijenite lokaciju signala i pozadinu. Za vijabilnost zahtijevajte dokaze koji nadilaze privlačno razdvajanje boja. Širi vodič o bojenju metilenskim plavilom i laboratorijskim primjenama objašnjava kako su opažanje i priprema međusobno povezani.
Izaberite alternativu koja čuva mjerenje koje vam je potrebno. Boja je samo jedno svojstvo dobijene slike.