নিবন্ধ
G6PD ল্যাবরেটরি পরীক্ষায় মিথিলিন ব্লু: রঞ্জকটি আসলে কী করছে
একজন শিক্ষার্থী ইনকিউবেশনের পর দুটি টিউব দেখছে। একটিতে প্রত্যাশিত রং দেখা গেছে। অন্যটিতে তা দেখা যায়নি। শিক্ষার্থী সিদ্ধান্ত নেয় যে দ্বিতীয় রোগীর glucose-6-phosphate dehydrogenase-এর ঘাটতি আছে। সিদ্ধান্তটি সঠিক হতে পারে, কিন্তু এই পরীক্ষা কীভাবে কাজ করে সেই মূল ধারণাটি এই যুক্তিতে বাদ পড়েছে। টিউবের কোনো কিছুই এনজাইমকে সরাসরি পরিমাপ করে না। টিউবটি পরিমাপ করে এনজাইম কী উৎপন্ন করে, যেখানে মিথিলিন ব্লু মধ্যস্থতাকারী হিসেবে কাজ করে।
এই পরোক্ষ প্রক্রিয়াটি পরিষ্কার হলে পদ্ধতি, নিয়ন্ত্রণ এবং মিথ্যা ফলাফলের দীর্ঘ তালিকা আর এলোমেলো মনে হয় না।
সংক্ষিপ্ত উত্তর
G6PD পরীক্ষায় মিথিলিন ব্লু একটি রেডক্স নির্দেশক। এনজাইম G6PD NADPH তৈরি করে, এবং NADPH-নির্ভর ব্যবস্থা নীল মিথিলিন ব্লুকে তার বর্ণহীন লিউকো রূপে হ্রাস করে (অথবা ইলেকট্রন স্থানান্তরের মাধ্যম হিসেবে ব্যবহার করে)। স্বাভাবিক এনজাইম কার্যকলাপ কার্যকর হ্রাস ঘটায়। ঘাটতিপূর্ণ কার্যকলাপ ধীর বা অসম্পূর্ণ হ্রাস ঘটায়। এটিই পুরো সংকেত।
দুটি ঐতিহাসিক পদ্ধতিতে একই রঞ্জক ব্যবহার করা হয়, কিন্তু শেষ পর্যায় আলাদা। এগুলো আলাদা রাখলে বেশিরভাগ বিভ্রান্তি দূর হয়।
দুটি পরীক্ষা, একটি রঞ্জক, ভিন্ন শেষ পর্যায়
প্রথমটি হলো সরাসরি মিথিলিন ব্লু হ্রাস পরীক্ষা, যা Sass এবং সহকর্মীরা বর্ণনা করেছিলেন এবং পরে Gibbs মূল্যায়ন করেন। এখানে শেষ পর্যায় হলো রঞ্জক নিজেই: অক্সিডাইজড নীল মিথিলিন ব্লু হ্রাস পেয়ে বর্ণহীন leucomethylene blue-এর দিকে যায়, এবং এই পরিবর্তনের গতি NADPH উৎপাদন ক্ষমতা প্রতিফলিত করে। প্রাথমিক স্ক্রিনিং গবেষণাটি PubMed-এ Sass et al. (1966) এর অধীনে তালিকাভুক্ত।
দ্বিতীয়টি হলো Brewer methemoglobin reduction test। Sodium nitrite প্রথমে হিমোগ্লোবিনকে বাদামি methemoglobin-এ অক্সিডাইজ করে। এরপর মিথিলিন ব্লু ইলেকট্রন স্থানান্তর মধ্যস্থতাকারী হিসেবে কাজ করে: হ্রাসপ্রাপ্ত মিথিলিন ব্লু হ্রাসকারী সমতুল্য methemoglobin-এ স্থানান্তর করে এবং এটিকে আবার লাল হিমোগ্লোবিনে রূপান্তর করে। তাই দৃশ্যমান শেষ পর্যায় হলো বাদামি বনাম লাল, নীল বনাম বর্ণহীন নয়। মূল পদ্ধতিটি Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960) এ প্রকাশিত হয়েছিল।
Brewer assay-কে রঞ্জক বিবর্ণকরণ পরীক্ষা বলা রাসায়নিকভাবে সঠিক নয়। রঞ্জকটি চক্রাকারে পরিবর্তিত হয়; হিমোগ্লোবিনের রং পরিবর্তিত হয়। নিচের চিত্রে উভয় পথ দেখানো হয়েছে।
অন্তর্নিহিত বিক্রিয়া
G6PD pentose phosphate pathway-এর প্রথম অক্সিডেটিভ ধাপটি অনুঘটিত করে:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
পরিণত লোহিত রক্তকণিকা NADPH-এর জন্য এই পথের ওপর ব্যাপকভাবে নির্ভর করে, যেমন Blood by Luzzatto and colleagues (2020)-এ পর্যালোচনা করা হয়েছে। NADPH glutathione-কে হ্রাসপ্রাপ্ত অবস্থায় রাখে এবং কোষকে অক্সিডেটিভ ক্ষতি থেকে রক্ষা করে। মিথিলিন ব্লু এই ব্যবস্থায় ইলেকট্রন গ্রহণকারী হিসেবে যুক্ত হয়। পর্যাপ্ত G6PD পর্যাপ্ত NADPH দেয়, যা কার্যকর হ্রাস ঘটায়। কম G6PD প্রথম ধাপেই এই শৃঙ্খল ভেঙে দেয়।
রঞ্জকটিকে ইঞ্জিন নয়, জ্বালানি পরিমাপক হিসেবে ভাবুন। এটি NADPH সরবরাহ সম্পর্কে তথ্য দেয়। এই সরবরাহ বা ফলাফল পড়ার পদ্ধতিতে অন্য কোনো পরিবর্তন হলে, জিনে কোনো পরিবর্তন না থাকলেও ফলাফল পরিবর্তিত হতে পারে।
Brewer-ধরনের পদ্ধতি কীভাবে পরিচালিত হয়
দশকের পর দশক ধরে reagent-এর প্রস্তুতি পরিবর্তিত হয়েছে, তাই শিক্ষামূলক বর্ণনাকে ক্লিনিক্যাল প্রোটোকল হিসেবে বিবেচনা করা উচিত নয়। প্রতিটি ল্যাবরেটরি নিজস্ব যাচাইকৃত standard operating procedure অনুসরণ করে। এই সতর্কতার সঙ্গে, এই প্রকাশিত প্রয়োগে নথিভুক্ত তিনটি টিউব এবং 3-hour incubation সহ ধ্রুপদী টিউব ব্যবস্থা নিম্নরূপ:
- Patient tube: whole blood-এর সঙ্গে glucose, sodium nitrite এবং methylene blue। Nitrite methemoglobin তৈরি করে, glucose লোহিত রক্তকণিকার বিপাককে সহায়তা করে, এবং রঞ্জক NADPH-নির্ভর shuttle প্রদান করে।
- Oxidized control: blood-এর সঙ্গে nitrite এবং glucose, কিন্তু methylene blue নেই। এটি বাদামি methemoglobin endpoint দেখায়, যা ঘাটতির ধরন।
- Hemoglobin control: blood-এর সঙ্গে water। এটি লাল hemoglobin endpoint দেখায়, যা স্বাভাবিক ধরন।
- Incubate সব টিউব প্রায় 37 C তাপমাত্রায়, সাধারণত 3 hours ধরে, হালকাভাবে মিশিয়ে।
- Dilute প্রতিটি টিউবের অল্প aliquot distilled water-এ মিশিয়ে কোষ ভেঙে দেওয়া হয় এবং রং তুলনা সহজ করা হয়।
- Compare patient tube-কে দুটি control-এর সঙ্গে তুলনা করুন। লালের দিকে ফিরে আসা উল্লেখযোগ্য reducing capacity নির্দেশ করে। বাদামি রং বজায় থাকা স্পষ্ট ঘাটতির ইঙ্গিত দেয়।
একটি ঐতিহাসিক formulation-এ প্রায় 1 mL blood-এর সঙ্গে প্রায় 180 mM sodium nitrite, 280 mM dextrose এবং 0.4 mM methylene blue reagent ব্যবহার করা হয়েছিল। এগুলোকে সাহিত্যে পাওয়া একটি উদাহরণ হিসেবে বিবেচনা করুন, সর্বজনীন specification হিসেবে নয়।
ফলাফল পড়া
| Pattern | Brewer appearance | Meaning |
|---|---|---|
| Normal | Patient tube approaches the red hemoglobin control | Reducing capacity above the screen threshold |
| Deficient | Patient tube stays brown, near the methemoglobin control | Screen suggests marked G6PD deficiency |
| Intermediate | Color falls between the controls | Do not assign a phenotype; measure activity quantitatively |
একটি qualitative screen সাধারণত স্বাভাবিক কার্যকলাপের 30 থেকে 40 শতাংশের কাছাকাছি সর্বোত্তমভাবে পার্থক্য করতে পারে, যেমন G6PD detection gaps-এর Malaria Journal review-এ আলোচনা করা হয়েছে। তাই স্বাভাবিক screening ফলাফল মানে হলো assay গুরুতর ঘাটতি শনাক্ত করেনি। এটি সম্পূর্ণ স্বাভাবিক কার্যকলাপ নিশ্চিত করে না।
কেন স্ক্রিনিং বিভ্রান্তিকর হতে পারে
Hemolysis-এর পর reticulocytosis হলো ক্লাসিক false normal। তরুণ লোহিত রক্তকণিকা এবং reticulocyte-এ পুরোনো কোষের তুলনায় বেশি G6PD থাকে। তীব্র hemolytic episode-এর সময় সবচেয়ে পুরোনো এবং সবচেয়ে ঘাটতিপূর্ণ কোষ ইতিমধ্যে ধ্বংস হয়ে যেতে পারে, ফলে একটি তরুণ কোষসমষ্টি তৈরি হয় যার কার্যকলাপ স্বাভাবিক পরীক্ষা হতে পারে। একই জীববৈজ্ঞানিক বিষয় quantitative assay-কেও প্রভাবিত করে, শুধু dye screen-কে নয়।
Recent transfusion ঘাটতি আড়াল করতে পারে, কারণ donor লোহিত রক্তকণিকা নমুনায় নিজস্ব enzyme যোগ করে। Mayo Clinic Laboratories transfusion-কে unreliable enzyme results-এর কারণ হিসেবে reticulocytosis এবং leukocyte interference-এর পাশাপাশি তালিকাভুক্ত করেছে।
Heterozygous females সবচেয়ে কঠিন ক্ষেত্র। Random X-chromosome inactivation স্বাভাবিক এবং ঘাটতিপূর্ণ লোহিত রক্তকণিকার মিশ্রণ তৈরি করে, এবং সামগ্রিক কার্যকলাপ গুরুতর ঘাটতি থেকে আপাত স্বাভাবিক পর্যন্ত যেকোনো স্তরে থাকতে পারে। Qualitative screen প্রায়ই intermediate phenotype শনাক্ত করতে ব্যর্থ হয়। WHO documentation on G6PD testing-এ এই সীমাবদ্ধতা বিস্তারিত আলোচনা করা হয়েছে।
Specimen age, storage temperature, visual endpoint subjectivity, hematocrit এবং reagent quality এই জৈবিক প্রভাবগুলোর সঙ্গে অতিরিক্ত analytical noise যোগ করে।
Screening diagnosis নয়
একটি deficient, intermediate, বা clinically discordant screening ফলাফলের জন্য quantitative G6PD enzyme assay প্রয়োজন। WHO temperature-controlled quantitative spectrophotometry-কে reference approach হিসেবে বিবেচনা করে। এই assay-তে red-cell hemolysate-এ glucose-6-phosphate এবং NADP+ যোগ করা হয়, এবং তৈরি হওয়া NADPH-কে 340 nm-এ absorbance বৃদ্ধির মাধ্যমে পর্যবেক্ষণ করা হয়। পরিবর্তনের হার enzyme activity-এর সমানুপাতিক, যা সাধারণত hemoglobin-এর সঙ্গে units per gram হিসেবে স্বাভাবিক করা হয়। বর্তমান clinical-laboratory practice Mayo test catalog entry for G6PD activity-এ সংক্ষেপে দেওয়া হয়েছে।
ব্যাখ্যার ক্ষেত্রে laboratory validated reference range ব্যবহার করা হয়, যা প্রায়ই population normal activity-এর তুলনায় উপস্থাপিত হয়, যেখানে deficiency সাধারণত 30 percent threshold-এর কাছাকাছি এবং intermediate activity তার উপরে আলোচনা করা হয়। WHO target product profiles for G6PD tests (2022)-এ এই diagnostic framework নির্ধারণ করা হয়েছে। যদি recent hemolysis বা transfusion-এর কারণে phenotype নির্ভরযোগ্য না হয়, তবে red-cell population পুনরায় ভারসাম্যপূর্ণ হওয়ার পরে পুনরায় পরীক্ষা করা যেতে পারে, এবং molecular testing enzyme measurement-এর বিকল্প না হয়ে অতিরিক্ত তথ্য দিতে পারে।
একটি সীমারেখা মনে রাখা দরকার
এই assay-তে মিথিলিন ব্লু হলো একটি ex vivo laboratory reagent। এই বিষয়টি রোগীকে methylene blue দেওয়ার নিরাপত্তার আলোচনার থেকে আলাদা, যা guidance on methylene blue contraindications-এ আলোচনা করা হয়েছে। জৈব রাসায়নিক সংযোগ রয়েছে, কারণ ওষুধটিও NADPH-নির্ভর হ্রাসের ওপর নির্ভর করে, কিন্তু test tube-এর একটি dye রক্তপ্রবাহে একটি dose নয়। ভিন্ন প্রেক্ষাপটে stain হিসেবে রঞ্জকটির আচরণ সম্পর্কে জানতে methylene blue staining principles দেখুন, এবং এটি যে chemistry family-এর অন্তর্ভুক্ত তার জন্য laboratory-র redox dyes দেখুন।
Screening জিজ্ঞাসা করে reducing capacity অক্ষত দেখাচ্ছে কি না। Confirmation জিজ্ঞাসা করে আসলে কত enzyme আছে। রঞ্জক প্রথম প্রশ্নের উত্তর দিতে কার্যকর, যতক্ষণ না কেউ এটিকে দ্বিতীয় প্রশ্নের উত্তর দিতে বলে।