EMB আগারে E. coli ও অন্যান্য কলোনির চেহারা পড়া

একজন শিক্ষার্থী অজানা একটি নমুনা eosin methylene blue agar-এ স্ট্রিক করে, রাতভর ইনকিউবেট করে এবং পরে সবুজ ঝিলিকযুক্ত গাঢ় কলোনিতে ভরা একটি প্লেট দেখতে পায়। নোটবুকে লেখা হয়, "E. coli, confirmed." এই মন্তব্যটি প্লেট থেকে যতটুকু সমর্থন পাওয়া যায় তার চেয়ে বেশি দাবি করে। প্লেটটি নির্দিষ্ট শর্তে বৃদ্ধি ও ফারমেন্টেশনের একটি ফেনোটাইপ দেখায়। প্রজাতির পরিচয় আলাদা একটি দাবি, যার জন্য আলাদা প্রমাণ দরকার।

এই নির্দেশিকায় EMB agar-এর ফলাফলকে ব্যাখ্যার একটি কাজ হিসেবে বিবেচনা করা হয়েছে। এতে মূল ধারণাটি ব্যাখ্যা করা হয়েছে, কন্ট্রোলসহ একটি উদাহরণমূলক প্লেট অ্যাটলাস দেখানো হয়েছে এবং যেসব ক্ষেত্রে পাঠ্যবইয়ের আদর্শ চিত্র বিভ্রান্ত করতে পারে সেগুলো চিহ্নিত করা হয়েছে।

প্লেটটির পেছনের ধারণা

EMB agar একই সঙ্গে সিলেক্টিভ ও ডিফারেনশিয়াল। eosin Y এবং methylene blue রঞ্জক অনেক Gram positive জীবের বৃদ্ধি দমন করে, ফলে এই মাধ্যম Gram negative বৃদ্ধিকে অগ্রাধিকার দেয়। একই রঞ্জক ইন্ডিকেটর হিসেবেও কাজ করে: কোনো জীব উপলভ্য শর্করা ফারমেন্ট করে স্থানীয়ভাবে যথেষ্ট অ্যাসিড তৈরি করলে কলোনিটি বেশি রঞ্জক গ্রহণ করে এবং গাঢ় বেগুনি থেকে নীল-কালো হয়ে যায়। প্রবল অ্যাসিড উৎপাদন হলে কলোনির পৃষ্ঠে ধাতব সবুজ ইরিডেসেন্স দেখা যেতে পারে। eosin methylene blue agar প্লেটের জন্য ASM প্রোটোকল সিলেকশন ও ডিফারেনশিয়েশনের এই সমন্বয় বর্ণনা করে এবং শিক্ষার জন্য রেফারেন্স ফটোগ্রাফ দেয়।

কোনো ফলাফল পড়ার আগে একটি বিষয় গুরুত্বপূর্ণ: কোন ফর্মুলেশন ব্যবহার হচ্ছে তা পরীক্ষা করুন। পুরোনো Holt Harris Teague ফর্মুলেশনে lactose-এর সঙ্গে sucrose থাকে, আর Levine EMB-তে শুধু lactose থাকে। অনেক Serratia marcescens আইসোলেটের মতো কোনো জীব sucrose ফারমেন্ট করলেও lactose না করলে, দুটি সংস্করণে তার চেহারা ভিন্ন হতে পারে। EMB মিডিয়ার প্রস্তুতকারকের ডকুমেন্টেশন এই ফর্মুলেশন পার্থক্যটি স্পষ্টভাবে উল্লেখ করে। ফলাফলের পাশাপাশি নোটবুকে প্রস্তুতকারক ও ফর্মুলেশন লিখে রাখুন।

ইনোকুলেট না করা প্রস্তুত EMB agar সাধারণত লালচে-বাদামি থেকে লালচে-বেগুনি হয়, কখনো সবুজাভ আভা বা সূক্ষ্ম প্রিসিপিটেট থাকতে পারে। এই পটভূমির রং বৃদ্ধি নয়। প্রতিটি ফলাফল ইনোকুলেট না করা প্লেট বা নথিভুক্ত বেসলাইনের সঙ্গে তুলনা করুন এবং শিক্ষণ প্রোটোকলে অন্য কিছু উল্লেখ না থাকলে 35 to 37 C তাপমাত্রায় প্রায় 18 to 24 hours অ্যারোবিক ইনকিউবেশনের পর প্রাথমিক প্লেট পড়ুন। দীর্ঘায়িত ইনকিউবেশন ফারমেন্টেশনের চেহারা বদলে দিতে পারে।

প্লেট কীভাবে পর্যবেক্ষণ করবেন

দুই ধরনের আলো ব্যবহার করুন। প্রথমে প্রতিফলিত বা তির্যক আলোতে প্লেটটি পরীক্ষা করে কাত করুন: ধাতব ঝিলিকটি ইরিডেসেন্ট, তাই দেখার কোণ বদলালে এটি দেখা দিতে বা অদৃশ্য হতে পারে। এরপর ট্রান্সমিটেড আলোতে দেখে কলোনির রং ও গাঢ় কেন্দ্র বিচার করুন। ভালোভাবে বিচ্ছিন্ন কলোনি থেকে কাজ করুন, কারণ ঘন বৃদ্ধি ও আশপাশের কলোনি স্থানীয় অ্যাসিড সঞ্চয় বদলে দেয় এবং রং কমিয়ে বা বাড়িয়ে দেখাতে পারে। ASM ইমেজ সেট এটি সরাসরি দেখায়: মিশ্র কালচারে E. coli-এর প্রত্যাশিত ঝিলিক হারিয়ে যেতে পারে, কারণ আশপাশের জীবগুলো অ্যাসিডের পরিবেশ পরিবর্তন করে।

অনুশীলনে সম্ভব হলে কন্ট্রোল অন্তর্ভুক্ত করুন। সাধারণ শিক্ষণ সেটে নীল-কালো ও ধাতব ঝিলিক ফেনোটাইপের জন্য E. coli ATCC 25922, বর্ণহীন ফেনোটাইপের জন্য Salmonella Typhimurium ATCC 14028 বা Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-এর মতো একটি ননফারমেন্টার এবং ইনহিবিশন কন্ট্রোল হিসেবে Enterococcus faecalis বা Staphylococcus aureus-এর মতো একটি Gram positive ব্যবহার করা হয়, যেমন EMB মিডিয়ার স্ট্যান্ডার্ড QC টেবিলে দেখানো হয়েছে। পজিটিভ কন্ট্রোলে ঝিলিক না থাকলে অজানা নমুনাকে সন্দেহ করার আগে ইনকিউবেশন, অতিরিক্ত ঘন বৃদ্ধি বা ফর্মুলেশন নিয়ে সন্দেহ করুন।

উদাহরণমূলক প্লেট অ্যাটলাস

নিচের প্লেটগুলো তৈরি করা ইলাস্ট্রেশন, বাস্তব কালচারের ফটোগ্রাফ নয়। এগুলো কোন প্যাটার্ন খুঁজতে হবে তা দেখায়, কোনো একক স্ট্রেইনের সুনির্দিষ্ট রঙের শেড নয়। এগুলো ASM রেফারেন্স ফটোগ্রাফ এবং শিক্ষণ ল্যাবরেটরির বাস্তব প্লেটের সঙ্গে তুলনা করুন।

প্লেট 1: EMB agar-এ Escherichia coli, প্রবল lactose fermenter

EMB agar-এ E. coli সাধারণত গাঢ় বেগুনি থেকে নীল-কালো হয়, প্রায়ই গাঢ় কেন্দ্র এবং প্রবল অ্যাসিড উৎপাদনের কারণে ধাতব সবুজ ঝিলিক থাকে। শিক্ষার্থীরা এই ঝিলিকটিই সবচেয়ে বেশি খোঁজে, তবে এটিকে সংজ্ঞা নয়, সহায়ক প্রমাণ হিসেবে বিবেচনা করুন। স্ট্রেইন, ইনকিউবেশনের সময়, কলোনির ঘনত্ব ও দেখার কোণের কারণে ঝিলিকের তীব্রতা পরিবর্তিত হয়। ঝিলিক না থাকা E. coli-কে বাদ দেয় না, আর ঝিলিকবিহীন গাঢ় কলোনি আরও কয়েক ধরনের ফারমেন্টারের দিকে ইঙ্গিত করতে পারে। পরবর্তী যেকোনো কাজের জন্য ঘন অংশ থেকে পড়ার বদলে ভালোভাবে বিচ্ছিন্ন একটি কলোনি বেছে নিন।

প্লেট 2: EMB agar-এ Klebsiella pneumoniae, মিউকয়েড ফারমেন্টার

EMB agar-এ Klebsiella pneumoniae সাধারণত বড়, চকচকে, মিউকয়েড কলোনি তৈরি করে, যার রং গোলাপি-বেগুনি থেকে বাদামি-বেগুনি হতে পারে এবং প্রায়ই গাঢ় কেন্দ্র থাকে, তবে সাধারণত শক্তিশালী ধাতব ঝিলিক থাকে না। Enterobacter-এর মতো সংশ্লিষ্ট ফারমেন্টারেও একই ধরনের মর্ফোলজি দেখা যায়। মিউকয়েড টেক্সচার ও কলোনির আকারও পর্যবেক্ষণের অংশ: ছোট ও সমতল একটি গোলাপি কলোনির তাৎপর্য বড়, গম্বুজাকৃতি মিউকয়েড কলোনির মতো নয়। E. coli-এর মতো এখানেও প্লেটটি একটি ফারমেন্টেশন ফেনোটাইপের ইঙ্গিত দেয়; প্রজাতি-স্তরের নামকরণের জন্য নিচে বর্ণিত বায়োকেমিক্যাল নিশ্চিতকরণ দরকার।

প্লেট 3: EMB agar-এ Salmonella এবং অন্যান্য ননফারমেন্টার, বর্ণহীন কলোনি

EMB agar-এ Salmonella এবং Shigella ও অনেক Pseudomonas আইসোলেটসহ সংশ্লিষ্ট non lactose fermenter সাধারণত বর্ণহীন থেকে স্বচ্ছ বা ফ্যাকাশে অ্যাম্বার কলোনি হিসেবে বৃদ্ধি পায়। কিছু ফর্মুলেশন ও অবস্থায় হালকা গোলাপি আভা দেখা দিতে পারে, তাই ফ্যাকাশে গোলাপি কলোনিকে স্বয়ংক্রিয়ভাবে ফারমেন্টার বলা যাবে না। EMB Salmonella-কে Shigella বা অন্য ননফারমেন্টার থেকে আলাদা করতে পারে না; এই পার্থক্য পরবর্তী পরীক্ষার বিষয়। আরও মনে রাখুন, E. coli-এর মতো ধাতব কলোনি তৈরি করা lactose positive Salmonella স্ট্রেইন নথিভুক্ত হয়েছে, যা একটিমাত্র প্লেট দিয়ে সিদ্ধান্ত চূড়ান্ত না করার আরেকটি কারণ।

প্লেট 4: Serratia marcescens এবং ফর্মুলেশনের ফাঁদ

Serratia marcescens-এর জন্য আলাদা অংশ দরকার, কারণ শিক্ষার্থীরা প্রায়ই লাল কলোনি আশা করে এবং তারপর প্লেট ভুলভাবে পড়ে। অধিকাংশ ক্লিনিক্যাল আইসোলেট lactose ফারমেন্ট করে না, তাই Levine EMB-তে এগুলো সাধারণত ফ্যাকাশে থেকে দুর্বল রঙের দেখা যায়। অনেক আইসোলেট sucrose ফারমেন্ট করে বলে sucrose-যুক্ত ফর্মুলেশনে গাঢ় বা অ্যাসিডের সঙ্গে বেশি সম্পর্কিত প্রতিক্রিয়া দেখা যেতে পারে। 35 to 37 C তাপমাত্রায়ও ক্লাসিক লাল prodigiosin পিগমেন্ট প্রত্যাশা করবেন না; ইনকিউবেটরের তাপমাত্রায় পিগমেন্ট উৎপাদন নির্ভরযোগ্য নয়। প্রোটোকলে EMB agar-এ Serratia marcescens-এর উল্লেখ থাকলে বক্তব্যটি কোন ফর্মুলেশন ধরে নেওয়া হয়েছে তা পরীক্ষা করুন। Serratia মেটাবলিজমের একটি পর্যালোচনা এই বিভ্রান্তির পেছনের lactose negative ও sucrose variable প্যাটার্নটি সংক্ষেপে তুলে ধরে।

প্লেট 5: কন্ট্রোল ও দমিত জীব

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus ও Bacillus-এর মতো Gram positive জীব সাধারণত EMB agar-এ দমিত বা উল্লেখযোগ্যভাবে কম বৃদ্ধি পায়, যদিও প্রতিটি স্ট্রেইনের ক্ষেত্রে ইনহিবিশন সম্পূর্ণ নয়। একটি কন্ট্রোল প্যানেল পর্যবেক্ষণকে নির্ভরযোগ্য রাখে: E. coli কন্ট্রোলে ভালো বৃদ্ধি, নীল-কালো রং ও ঝিলিক দেখা উচিত; ননফারমেন্টার কন্ট্রোলে বর্ণহীন বৃদ্ধি দেখা উচিত; আর ইনহিবিশন কন্ট্রোলে সামান্য বা কোনো বৃদ্ধি থাকা উচিত নয়। ইনহিবিশন কন্ট্রোল ভালোভাবে বৃদ্ধি পেলে সিলেক্টিভ ধাপটি ব্যর্থ হয়েছে এবং সেই ব্যাচের অন্য সব পর্যবেক্ষণ সন্দেহজনক। স্টেইনিং পদ্ধতি কালচার মিডিয়ার চেয়ে ভিন্ন প্রশ্নের উত্তর দেয়; ল্যাবরেটরির স্লাইড স্টেইন অংশের জন্য methylene blue staining atlas দেখুন।

সীমাবদ্ধ তুলনা

বিভ্রান্তিকর চেহারাগুলো তিনটি বাক্যে সংক্ষেপ করা যায়। গাঢ় মানেই E. coli নয়, কারণ Klebsiella, Enterobacter ও অন্যান্য ফারমেন্টারে ঝিলিক ছাড়াই গাঢ় কেন্দ্র তৈরি হতে পারে। গোলাপি মানেই Klebsiella নয়, কারণ মাঝারি বা ধীর ফারমেন্টার এবং নামমাত্র কিছু ননফারমেন্টারও গোলাপি বা ল্যাভেন্ডার দেখা যেতে পারে। ঝিলিক মানেই নিশ্চিত E. coli নয়, কারণ অন্য প্রবল ফারমেন্টারও এটি তৈরি করতে পারে। শিক্ষণ প্রোটোকল এবং এর মিশ্র কালচার চিত্র এই প্রতিটি ব্যর্থতার উদাহরণ দেখায়।

নিশ্চিতকরণের সীমাবদ্ধতা

EMB agar একটি ফেনোটাইপ জানায়, কোনো প্রজাতি নয়। ভিন্ন জীবের কলোনির চেহারা একই হতে পারে, আবার স্ট্রেইন, বয়স, অতিরিক্ত ঘন বৃদ্ধি, ফর্মুলেশন ও ইনকিউবেশনের কারণে একই জীব তার পাঠ্যবইয়ের আদর্শ চেহারা থেকে ভিন্ন হতে পারে। এ কারণেই শিক্ষণ ও ক্লিনিক্যাল ওয়ার্কফ্লোতে EMB মর্ফোলজিকে প্রাথমিক বা presumptive ফলাফল হিসেবে বিবেচনা করা হয়।

শিক্ষার্থীর জন্য একটি সমর্থনযোগ্য ওয়ার্কফ্লো হলো: বিচ্ছিন্ন কলোনিটির বর্ণনা দিন (আকার, রং, কেন্দ্র, তির্যক আলোতে ঝিলিক, মিউকয়েড বৈশিষ্ট্য), ফর্মুলেশন, ইনকিউবেশনের সময় ও তাপমাত্রা এবং কন্ট্রোল নথিভুক্ত করুন; এরপর যেকোনো নিশ্চিতকরণ পরীক্ষার আগে ভালোভাবে বিচ্ছিন্ন একটি কলোনি সাবকালচার করে বিশুদ্ধ করুন। প্রচলিত পরবর্তী পরীক্ষার মধ্যে presumptive E. coli ও coliform শনাক্তকরণের জন্য Gram stain-এর সঙ্গে IMViC রিঅ্যাকশন, enteric জীবের জন্য TSI বা KIA এবং organism specific বায়োকেমিক্যাল প্যানেল অন্তর্ভুক্ত থাকে; প্রয়োজন অনুযায়ী serologic, MALDI TOF বা অন্য validated identification ব্যবহার করা হয়। সিলেক্টিভ ও ডিফারেনশিয়াল enteric মিডিয়ার মধ্যে EMB কোথায় অবস্থান করে তার পটভূমির জন্য enteric culture media-এর পরিচিতি এবং Gram stain follow up দেখুন। আর নীল স্লাইড স্টেইন কী প্রমাণ করতে পারে এবং কী পারে না—এই সংশ্লিষ্ট প্রশ্নের জন্য methylene blue staining atlas একইভাবে পর্যবেক্ষণ ও সিদ্ধান্তকে আলাদা রাখে।

সিদ্ধান্তের আগে পর্যবেক্ষণ লিখুন। "24 hours-এ Levine EMB-তে কোণনির্ভর সবুজ ঝিলিকসহ গাঢ় নীল-কালো কলোনি, যা প্রবল lactose fermentation-এর সঙ্গে সামঞ্জস্যপূর্ণ" একটি সমর্থনযোগ্য বক্তব্য। "E. coli, confirmed" বলার জন্য এমন নিশ্চিতকরণ ধাপ দরকার, যা শুধু এই প্লেট থেকে পাওয়া যায় না।