Защо поглъщането на метиленовото синьо се променя с концентрацията

Вземете една бутилка изходен разтвор на метиленово синьо и напълнете две чаши. Напълнете първата с изходния разтвор, а втората — с десеткратно разреден разтвор. Втората чаша е по-бледа, както се очаква. Вгледайте се и ще видите, че има и друга промяна. Оттенъкът е различен. Единият разтвор клони към чисто небесносиньо, а другият — към синьо с виолетов оттенък. Разреждането не само намалява интензивността. То променя коя химична форма има най-голям принос към поглъщането.

Причината за тази промяна е проста. Разтвореното метиленово синьо не съществува само в една форма. Единичният катион на багрилото, наречен мономер, може да се подреди лице срещу лице с втори катион и да образува димер, а димерите могат да прераснат в по-големи агрегати. Всяка форма има собствен спектър на поглъщане. Спектрофотометърът отчита сумарното поглъщане на сместа в конкретната кювета при конкретните условия. Променете сместа и спектърът се променя, дори когато общото съдържание на багрилото следва точно съотношението на разреждане.

Мономерът и димерът поглъщат различно

Представете си мономера като плоска карта с положителен заряд, разпределен по пръстенната му система. Две такива карти могат да застанат лице срещу лице. Положителните заряди се отблъскват, но плоските ароматни повърхности се привличат чрез стекинг взаимодействия, а околната вода и противойоните екранират отблъскването. Резултатът е свързана двойка с общи електронни състояния. Разрешените ѝ преходи са при по-висока енергия от прехода на мономера, затова димерната ивица се появява при по-къса дължина на вълната от мономерната, а по-големите агрегати допринасят с рамо още по-навътре към синята страна на спектъра.

При много ниска концентрация в чиста вода преобладават мономерите и доминира дълговълновата ивица. С нарастването на общата концентрация сдвоената форма заема все по-голям дял и късовълновата ивица нараства спрямо първата. Следователно съотношението между двете ивици показва състава на сместа, а не пряко общата концентрация. Измерване при една дължина на вълната не може да разграничи двете форми без предположение коя от тях присъства.

Ето защо референтните спектри винаги трябва да се дават заедно с условията. В спектралния справочник за метиленово синьо положенията на ивиците са представени в таблица заедно с разтворителя, солевия фон, pH, температурата и концентрационния диапазон, при които са получени. Ако цитирате пик без тези условия, стойността не е достатъчно определена. Две лаборатории могат да бъдат еднакво прави за различни спектри на едно и също багрило, защото са измерили различни смеси.

Какво измества равновесието

Концентрацията е основният фактор. За образуването на димер трябва да се срещнат два мономера, затова делът му нараства по-бързо от линейно спрямо общата концентрация на багрилото. Публикуваните константи на димеризация във вода са от порядъка на хиляди обратни молара близо до стайна температура, така че делът на димерите нараства стръмно в микромоларния диапазон. Широкообхватно глобално напасване на данни от микромоларни до милимоларни концентрации на багрилото установява ненулев принос на тетрамерите още под 34 микромолара. Това предупреждава да не се разчита безусловно на модел със строго две форми при десетки микромолари. Точните дялове зависят от средата, затова тази статия описва посоките на промяна, вместо да предлага универсална таблица за преобразуване.

Солта е вторият фактор. Разтворените йони екранират отблъскването между два катиона, затова добавеният натриев хлорид и подобни електролити изместват сместа към димери и агрегати при същата концентрация на багрилото. Този ефект се вижда в изследвания на агрегирането на метиленово синьо в солеви и водни среди, в които багрилото е измерено при концентрации от около 1 микромолар до 3.4 милимолара и натриев хлорид от 0 до 0.15 молара. При това напасване делът на тетрамерите достига около 0.93 в областта с високи концентрации и на багрилото, и на солта. Следователно спектър, записан във вода, и спектър, записан във физиологичен разтвор, не са взаимозаменяеми референтни данни.

Температурата действа в обратната посока. Подреждането чрез стекинг освобождава свързана вода, а топлинното движение му противодейства. Затова затоплянето на разтвора обикновено дисоциира част от димерите обратно до мономери, докато охлаждането благоприятства асоциацията. Енталпията на дисоциация, получена при напасването, е отрицателна — около минус 30 килоджаула на мол в диапазона от 282 до 333 келвина, което потвърждава екзотермична асоциация. Студена проба, измерена веднага след изваждане от хладилник, може да изглежда по-агрегирана от същата проба, измерена след достигане на равновесие при стайна температура.

Разтворителят задава изходните условия. Водата със своя силен хидрофобен ефект насърчава плоските катиони на багрилото да се подреждат един върху друг. Алкохоли като етанол и метанол солватират пръстените по-добре и разрушават агрегатите, затова при една и съща концентрация багрилото изглежда по-мономерно в етанол, отколкото във вода. Апротонните съразтворители действат по същия начин: в смеси от вода и DMSO при 293 келвина добавеният DMSO потиска димеризацията, което сочи структурата на водата като движеща сила за стекинга. Повърхностноактивните вещества изискват внимание и в двете посоки. Над критичната им концентрация на мицелообразуване мицелите могат да солюбилизират мономерите поотделно и да възстановят спектър, подобен на мономерния. Под този праг повърхностноактивно вещество с противоположен заряд може вместо това да насърчи стекинга: при 100 микромолара багрило полимеризацията, предизвикана от SDS, достига максимум близо до 4 милимолара SDS — приблизително половината от концентрацията на мицелообразуване — преди да настъпи преразпределение при по-високи концентрации на повърхностноактивното вещество. Изследванията на влиянието на взаимодействията багрило–разтворител и организираните среди върху спектрите на метиленовото синьо показват колко силно непосредственото молекулно обкръжение, а не само общата концентрация, определя наблюдаваните ивици.

pH има значение главно в крайните области. В близкия до неутралния диапазон, използван в повечето лабораторни дейности, метиленовото синьо остава в познатата си синя катионна форма и агрегирането доминира спектралното поведение. Силно киселата или силно алкалната среда, окислително-редукционните реакции, които образуват безцветната левкоформа, както и свързването с белтъци и частици добавят състояния извън двойката мономер–димер. Когато спектърът се промени след добавяне на буфер, проверете състава му за соли и компоненти, способни да се свързват с багрилото, преди да припишете всичко само на pH. Справочникът за химията и протонирането разглежда тези въпроси за химичната идентичност отделно от въпроса за агрегирането, обсъждан тук.

Защо правата на Бер–Ламберт се огъва

Зависимостта на Бер–Ламберт гласи, че абсорбансът е равен на коефициента на поглъщане, умножен по концентрацията и по дължината на оптичния път. Това е закон за преброяване. Той предполага, че преброяваните обекти остават еднакви, когато броят им се променя: една поглъщаща форма, неизменен спектър, липса на химични промени с концентрацията, монохроматична измервателна светлина, липса на разсейване или повторно излъчване и светлина, която действително преминава по посочения път.

Агрегирането нарушава първото предположение. Формално общият абсорбанс остава сума по всички форми: дължината на оптичния път, умножена по коефициента на поглъщане на всяка форма и по собствената ѝ концентрация. Всяка форма се подчинява на закона. Сместа не се подчинява, защото концентрациите на отделните форми са нелинейни функции на общата концентрация на багрилото. Затова калибрационната крива на абсорбанса при мономерната ивица спрямо общата концентрация на багрилото започва като права в границата на силно разреждане и се огъва надолу с нарастване на концентрацията, защото всяко добавено количество носи пропорционално по-малко мономер. Кривата, измерена при димерната ивица, се огъва в обратната посока. Изследванията на агрегирането посочват точно този механизъм като източник на наблюдаваните отклонения от закона на Ламберт–Бер. Типичната грешка е да се напасне права през огънатата област и да се екстраполира. Правата е валидна само в диапазона и матрицата, за които е построена.

Разреждането създава подобен капан. Разреждането на концентриран изходен разтвор до измервателния диапазон на уреда не запазва съотношението между формите. В разредената проба в кюветата равновесието се измества към мономера, така че спектърът ѝ описва правилно разредената проба, но неправилно изходния разтвор. Обратното изчисляване на спектъра на изходния разтвор чрез увеличаване на стойностите на абсорбанса дава вярна оценка за общото съдържание само ако калибрацията вече отчита това изместване. То никога не възстановява първоначалната форма на ивиците. Всеки, който сравнява спектър на концентрат с референтен спектър на разреден разтвор, сравнява две различни смеси.

Дължината на оптичния път е част от резултата

Абсорбансът е пропорционален на разстоянието, което светлината изминава през пробата. Кювета от 10 mm дава десет пъти по-голям абсорбанс от кювета от 1 mm със същия разтвор. Тази пропорционалност е точна само за един и същ разтвор, а агрегирането прави това уточнение решаващо.

На практика дължината на оптичния път е средство за оставане във валидния диапазон. Дългият път осигурява чувствителност за разредени, предимно мономерни разтвори. Късият път позволява концентрирана проба да остане в измервателния диапазон без значително разреждане, което би променило равновесието. Изследователската програма за агрегирането, от която идват горните стойности, използва точно този подход: кювети от 1 сантиметър за багрило от 1.1 до 34 микромолара и кювети от 0.01 сантиметра за 94 микромолара до 3.4 милимолара. Платформите за микрокапкови измервания и четците за микроплаки добавят собствена геометрия, с къси и понякога променливи оптични пътища, както и повърхности, върху които катионното багрило може да се адсорбира. Посочвайте дължината на оптичния път заедно със стойността, така както спектралният справочник посочва разтворителя и солта. Абсорбанс без дължина на оптичния път не е резултат. Той е слух.

Дисциплината на измерване следва от механизма. Преди измерването оставете пробите да достигнат равновесие при една и съща температура. Използвайте еднакъв тип и ориентация на кюветите, съответстващи празни проби със същия солеви и буферен фон и чиста лабораторна посуда, защото метиленовото синьо се адсорбира върху стъкло и пластмаса, а оцветената кювета пази следа от последната концентрирана проба. Измервайте скоро след приготвянето, когато кинетиката на агрегирането е от значение, и изграждайте всяка калибрационна крива в същата матрица и при същата дължина на оптичния път като пробите с неизвестна концентрация. При визуални проверки помнете, че окото е лош спектрометър. Дали цветът на разтвора може да установи чистотата му е отделен въпрос с отрицателен отговор, а промените в оттенъка вследствие на агрегирането са една от причините.

Диаграма, която да държите до уреда

Фигурата по-долу обобщава статията в един справочен материал за лабораторната маса. Три разтвора съдържат едно и също багрило, но се различават по обща концентрация и солеви фон. Техните схематични спектри показват как дълговълновата мономерна ивица губи относителен дял за сметка на по-късовълновата димерна ивица с увеличаването на стекинга. Условията са изписани върху фигурата, защото без тях кривите не могат да се използват повторно. За измерени положения на ивиците при посочени условия използвайте спектралния справочник. За това как багрилото навлиза в клетките, след като е в разтвор, вижте навлизане в клетките чрез редукция и разпределение между фази. За това как светлинната доза и геометрията допълнително влияят върху фотохимичните измервания, вижте светлинна експозиция и геометрия на измерването.

Основното правило има две части. Спектърът характеризира сместа, която присъства в кюветата при посочените условия. Само калибрация, изградена при същите условия, превръща абсорбанса в обща концентрация.