Метиленово синьо и зрението: какво показват изследванията на ретината и докъде стигат

Читател попада на изследване, в което метиленовото синьо защитава ретината, и си задава естествения въпрос: трябва ли то да се поставя в окото? Изследванията за метиленовото синьо и зрението не отговарят на този въпрос, защото нито едно от ключовите проучвания не проверява подобна употреба. В едно багрилото е инжектирано в стъкловидното тяло на мишки заедно с токсин. В друго е добавено към средата, обграждаща изолирани клетки в лабораторен съд. В трето е поставено в питейната вода на мишки с мутация. Всеки резултат се отнася до съответния път на приложение и модел.

Тази статия разглежда три предклинични изследвания, два типа клетки на ретината и границата между защитата в лабораторни условия и клиничното лечение на очите. Общата картина е последователна: метиленовото синьо може да променя митохондриалния стрес в клетките на ретината при контролирани условия, но тази констатация не оправдава прилагането на търговски разтвори върху окото.

Два типа клетки, две различни заболявания

Ретината е изградена от слоеве и конкретният слой има значение. Светлината първо достига фоторецепторите във външната част на ретината. Техните сигнали преминават през междинни неврони до ганглийните клетки във вътрешната част на ретината, чиито аксони излизат през зрителния нерв. Диаграмата по-долу назовава слоевете по ред.

Ганглийните клетки на ретината са клетките, застрашени при глаукома и оптична невропатия. Когато в търсенията се споменават метиленово синьо и глаукома, обикновено става дума за този вътрешен слой и неговите аксони. Фоторецепторите са клетките, застрашени при дегенерация на външната ретина. Те имат най-високите енергийни потребности в ретината и функционират близо до предела на дихателния си капацитет, което им оставя малък резерв при нарушаване на функцията на митохондриалния комплекс I. Резултатът при един клетъчен тип не може да се пренася върху другия и трите изследвания по-долу ги разглеждат отделно. Общото умение да се разграничават моделите от заключенията е обяснено в как да четем изследвания за метиленовото синьо.

Ганглийни клетки в окото на жива мишка

В най-ранното от трите изследвания учените моделират оптична невропатия чрез микроинжектиране на ротенон в стъкловидното тяло на едното око на мишка, като използват другото око за контрол, в който се прилага само носителят. Ротенонът блокира митохондриалния комплекс I — входната точка, която предава нататък електроните от NADH. Дисфункцията на комплекс I е и характеристиката, която свързва този модел с наследствената оптична невропатия на Лебер — заболяване на ганглийните клетки и зрителния нерв.

След 24 часа слоят на ганглийните клетки в очите, третирани с ротенон, е по-тънък и съдържа по-малко клетки от този в контролните очи. Когато метиленовото синьо е инжектирано заедно с ротенона, това увреждане е предотвратено по дозозависим начин, като най-високата изследвана доза (0.07 mg/kg, далеч под LD50 при мишки) запазва както дебелината, така и броя на клетките. Паралелни тестове в мозъчни хомогенати показват два ефекта: метиленовото синьо обръща предизвикания от ротенона оксидативен стрес и спада в консумацията на кислород. Авторите предлагат ексцитотоксичен механизъм, при който ротенонът уврежда модулиращите амакринни клетки, ганглийните клетки се възбуждат прекомерно, а антиоксидантното действие прекъсва произтичащото увреждане. Предполагаемите химични процеси зад тази защита са описани подробно в митохондриални механизми на метиленовото синьо.

Този резултат има три ограничения. Багрилото е инжектирано заедно с токсина директно в окото, което представлява метод на доставяне, а не схема на лечение. Периодът на наблюдение е 24 часа. Освен това измерените стойности на цитохромоксидазата се повишават и в двете групи с увреждане, което авторите тълкуват като свръхактивност, а не като доказателство за възстановено дишане в живата ретина.

Ганглийни клетки, изолирани в лабораторен съд

Второто изследване изобщо не използва цяло око. Изследователите изолират първични ганглийни клетки на ретината от млади плъхове и ги излагат на ротенон, на индуктора на апоптоза стауроспорин или на ниски нива на кислород в продължение на 72 часа, след което измерват преживяемостта чрез оцветяване, разграничаващо живите от мъртвите клетки. Метиленовото синьо в концентрации от 1 и 10 микромолара в културалната среда подобрява преживяемостта при всяко увреждащо въздействие — приблизително от 1.5 до 1.9 пъти според условията. Съпътстващ тест показва, че метиленовото синьо запазва активността на цитохром c оксидазата при въздействие с водороден пероксид.

Това е фармакология на изолирани клетки. Съединението достига до клетките чрез дифузия през културалната среда при определена концентрация, без по пътя му да има роговица, слъзен филм, леща, стъкловидно тяло, кръвоснабдяване или имунна система. Именно тази опростеност е смисълът на модела: той показва, че самите ганглийни клетки могат да бъдат защитени, когато съединението достигне до тях. Той не показва дали капка върху повърхността на роговицата би доставила някаква определена концентрация до вътрешната ретина. Концентрации над 10 микромолара са избягвани поради токсичност за същите клетки — напомняне, че дозовият отговор в лабораторен съд действа и в двете посоки.

Фоторецептори при мишки с мутация и в клетъчна линия

Третото изследване се отнася до външната ретина. Учените използват мишки Harlequin с дефицит на апоптоза-индуциращия фактор, поради който комплекс I остава непълно сглобен, и изследват структурата на фоторецепторите, маркерите на външните сегменти и целостта на митохондриите на 11-месечна възраст. Метиленовото синьо се прилага системно чрез питейната вода след отбиването, в количество около 10 mg/kg на ден. Третираните мишки с мутация запазват по-голяма дебелина на ретината, повече родопсинови и опсинови маркери и по-здрава митохондриална структура в сравнение с нетретираните мишки с мутация.

Съпътстващата клетъчна работа използва клетки 661W — обезсмъртена миша клетъчна линия, подобна на фоторецепторите — изложени на ротенон със или без метиленово синьо за 24 часа. Преживяемостта се подобрява при 30 микромолара, а по-ниските концентрации нормализират съотношението NADH към NAD+ и намаляват оксидативния стрес. Забележителният детайл е какво метиленовото синьо не прави: то не възстановява ATP. Защитата е свързана с облекчаване на редокс стреса и отслабване на стресовите пътища, включително митохондриалния отговор към ненагънати белтъци и маркерите на митофагията, а не с възстановяване на енергийното снабдяване.

Това разграничение е важно за твърденията относно метиленовото синьо и ретината. Едно съединение може да запази жив фоторецептор, подложен на стрес, без да отстрани енергийния му дефицит, което ограничава всяка терапевтична интерпретация до редокс стреса, а не до цялостно подмладяване.

Трите изследвания едно до друго

Сравнението по-долу обозначава всяко изследване според модела и пътя на приложение, тъй като тези две колони определят какво може да подкрепи резултатът.

Всеки ред е предклиничен. В нито едно изследване не са включени пациенти, не е измервано зрението и не е изпитвана офталмологична лекарствена форма.

Защо това не е лечение на глаукома

Лечението на глаукомата понижава вътреочното налягане. Невропротекцията се стреми към нещо различно: да запази живи ганглийните клетки и техните аксони при стрес. Изследванията по-горе принадлежат към второто направление, а не към първото. Нито едно от тях не понижава налягането и нито едно не сравнява метиленовото синьо с лечение за понижаване на налягането. Ето защо утвърдените подходи към глаукомата и контрола на налягането остават отделен въпрос от редокс невропротекцията и защо резултат за клетъчна преживяемост не може да се тълкува като запазено зрение.

Разликите в пътя на приложение подкрепят този извод. Интравитреалното съвместно инжектиране поставя известно количество до ретината в момента на увреждането. Приемът чрез питейната вода излага цялото животно на веществото в продължение на месеци, при неизвестна концентрация в ретината. Културалната среда въздейства директно върху незащитени от други структури клетки. Нито един от тези подходи не предсказва каква част от локално приложена доза би преминала през роговицата, би избегнала отмиването със сълзите, би преминала през лещата и стъкловидното тяло и би достигнала до който и да е от двата слоя на ретината в полезна концентрация. Този проблем с доставянето е част от по-широкия въпрос за пътищата на приложение и разпределението на метиленовото синьо, при който всеки път изисква собствени измервания на концентрацията.

Разликите между тъканите добавят втора преграда. Багрило, достигнало до предната част на окото, не е достигнало до задната му част, а концентрация, която помага на един слой, може да увреди друг. Търговските разтвори не се произвеждат, стерилизират, буферират или консервират като офталмологични препарати, а чистотата, pH, осмолалитетът и помощните вещества имат значение при излагане на роговицата и вътреочните структури. Нищо в тези резултати за ретината не обосновава поставянето на такива разтвори в окото или върху него. Въпросите за стандартите на приготвяне принадлежат към темата за безопасността и боравенето с метиленово синьо.

Докъде стигат доказателствата

Разгледани заедно, трите публикации подкрепят едно ограничено твърдение: при контролирани условия метиленовото синьо може да облекчи митохондриалния редокс стрес в невроните на ретината и да запази тяхната структура. Твърдението важи само в рамките на тези условия. Моделите с токсини и генетични дефекти на комплекс I не са глаукома, друзи или диабетно заболяване. Кратките периоди на наблюдение и структурните крайни показатели не са трайно запазено зрение. А защитната концентрация в един компартмент не е доза за друг.

По-убедителна обосновка би изисквала отделни елементи: определена експозиция на ретината след клинично приложим път на въвеждане, функционални крайни показатели за зрението при животни, полза, независима от налягането, в модел, релевантен за глаукомата, а след това и данни за безопасност и ефикасност при хора. Докато такива данни липсват, връзката между метиленовото синьо и зрението остава изследователска хипотеза с ясни граници: правдоподобно митохондриално фармакологично действие в ретината, демонстрирано само в клетки и животни, без тези изследвания да осигуряват път към лечение на очите.