Може ли метиленовото синьо да заобиколи митохондриалния комплекс III? Защо проучванията се разминават

Две лаборатории проверяват дали метиленовото синьо може да заобиколи блокиран митохондриален комплекс III. Едната отговаря с „не“. Другата — с „да“. И двете разполагат с данни.

Първото проучване, с митохондрии от миши мозък, установява, че багрилото не може да го заобиколи. Второто, с мозъчни митохондрии от три вида гризачи, установява, че може отчасти. Трето проучване, с миши черен дроб, често се цитира в същия контекст, но проверява нещо друго. Поставете го на правилното място и половината объркване изчезва.

Няма универсален механизъм, който да бъде обявен. Има три експеримента с различни блокери, дози и измервани показатели. Първо разгледайте условията. Изводите следват от тях.

Какво означава заобикаляне тук

Електроните навлизат във веригата през комплекс I (от NADH) или комплекс II (от сукцинат), преминават през комплекс III към цитохром c, а след това през комплекс IV към кислорода. Изграденият по този път градиент е това, което клетката използва, за да произвежда ATP.

Твърдението за заобикаляне означава, че метиленовото синьо приема електрони преди блокираното място и ги предава след него. Окисленото багрило приема електрони от NADH или от начални компоненти на веригата, превръщайки се в левкометиленово синьо, а редуцираната форма ги предава на цитохром c или обратно във веригата. Ако предаването се случва след блокираното място, дишането и мембранният потенциал частично се възстановяват. Ако се случва на самото блокирано място или преди него, нищо не се възстановява.

Една особеност на комплекс III определя голяма част от този спор. Комплексът осъществява Q-цикъл с две места за свързване на инхибитори. Антимицинът се свързва с мястото Qi. Миксотиазолът се свързва с мястото Qo. Проучване, което използва само единия от тях, е проверило само половината от комплекса.

Първо проучване: няма заобикаляне в митохондрии от миши мозък

Гуреев и колеги използват митохондрии от мозъчната кора на мишки C57BL/6, изолирани с дигитонин и изследвани при 0.1 mg протеин на ml. Субстратите обхващат три режима: пируват плюс малат по 5 mM всеки, сукцинат при 10 mM с глутамат при 2 mM и L-пролин при 10 mM. Блокерите са ротенон при 1 микромолар (комплекс I) и антимицин при 1 микрограм на ml (комплекс III). Дозите на багрилото са 0.5, 1 и 2 микромолара, като основната концентрация е 1 микромолар. Методите и записите от измерванията са представени в публикацията във FEBS Letters.

Заобикалянето на комплекс I работи. Ротенонът понижава стимулираното от ADP дишане от около 121 до около 2 nmol в минута на mg, а 1 микромолар багрило го възстановява до около 21. Мембранният потенциал се възстановява при пируват плюс малат и при L-пролин.

Заобикалянето на комплекс III не работи. Антимицинът понижава дишането до около 16, а багрилото го повишава само до около 20. Мембранният потенциал не се възстановява при нито един субстрат, при дози на багрилото до 5 микромолара. Данните за пероксида сочат същото: само багрилото увеличава отделянето на пероксид от базова скорост около 76 pmol в минута на mg до приблизително 1170, 1460 и 1945 при трите дози, но антимицинът намалява този предизвикан от багрилото сигнал съответно с около 25, 88 и 96 процента. Ако редуцираното багрило реагираше директно с кислорода, блокирането на комплекс III не би трябвало да потиска сигнала. Авторите заключават, че редуцираното багрило се окислява на мястото Qo на комплекс III, преди блокираното от антимицин място. Краткият обход, описан с думи: от донорите към багрилото, от багрилото към Qo, след това по нормалния път. Ротенонът се заобикаля. Антимицинът — не.

Второ проучване: частично заобикаляне при три вида и при двете места за свързване на инхибитори

Сваб и колеги разширяват експерименталния дизайн. Използват мозъчни митохондрии от мишки, плъхове и морски свинчета, изолирани с Percoll и изследвани при същите 0.1 mg на ml, с пируват плюс малат или глутамат плюс малат по 5 mM всеки. Използват два блокера на комплекс III: антимицин A при 0.3 микромолара и миксотиазол при 1 микромолар. Багрилото е 2 микромолара в повечето измервания и 0.5 в експериментите с цитохром c. Данните за трите вида, изследвани по съпоставими протоколи, са в статията с отворен достъп.

И двете блокади се заобикалят частично при всичките три вида. В мишите митохондрии антимицинът потиска дишането, а багрилото го повишава с около 60 процента, от приблизително 37 до 59 nmol в минута на mg. Миксотиазолът го потиска с 88 процента, до около 4.5, а багрилото го повишава петкратно до около 23. Мембранният потенциал частично се възстановява при всеки от двата инхибитора, като се измерва с две багрила (сафранин O и рациометричен TMRM), за да се изключат оптични артефакти.

Тази статия проверява и предаването на електрони директно, което първото проучване не прави. Екзогенният ацетилиран цитохром c при 25 микромолара не се редуцира от енергизирани митохондрии със или без инхибитори, но добавянето на багрило предизвиква редукция и в двата случая. В буфер без клетки NADH плюс багрило редуцират цитохром c със скорост, пропорционална на NADH. По-дългият преход, описан с думи: от редукционните еквиваленти към багрилото, от багрилото директно към цитохром c, през комплекс IV към кислорода. Този път изцяло прескача комплекс III, така че и двата блокера могат да бъдат заобиколени.

Още два показателя подкрепят това тълкуване. Флуоресценцията на NAD(P)H намалява при добавяне на багрило към митохондрии, третирани с миксотиазол, което означава, че редукционните еквиваленти се отвеждат по новия път. Абсорбцията на багрилото при 660 nm проследява последователно всяко добавяне, а центрофугираните супернатанти показват, че окисленото багрило се натрупва над стократно в енергизираните митохондрии, след което ги напуска при срив на потенциала. Балансът на протоните също съответства: пропускането на етапите на изпомпване оставя приблизително 2 протона на електронна двойка вместо 10, така че по-бързото използване на кислород при само частична реполяризация е очакваната картина при действително заобикаляне, а не доказателство срещу него.

Същият препарат дава резултати, които лесно могат да бъдат разтълкувани погрешно при повърхностно четене. При инхибитор плюс багрило ADP понижава дишането, вместо да го повишава, а блокирането на транспорта го стимулира, вместо да го забавя, докато мембранният потенциал все пак се променя в обичайните посоки. Само потреблението на кислород е подвеждащ показател в тази система.

Трето проучване: изследването с черен дроб, което проверява комплекси I и II, а не III

Лий и Бьолстерли използват митохондрии от миши черен дроб и култивирани хепатоцити, увредени от ефавиренц (комплекс I, IC50 около 30 микромолара) и хидразин, метаболита на изониазид (комплекс II, IC50 около 30 микромолара). Багрилото при около 30 микромолара възстановява окислението на NADH, мембранния потенциал и ATP, като същевременно намалява оксидантите и некротичната клетъчна смърт. Статията в Redox Biology представя това с модел, при който багрилото пренася електрони, заобикаляйки увредените комплекси I и II.

Този резултат е установен контекст за предходната част на веригата и не казва нищо за комплекс III, защото в него нищо не е блокирано на това място. Той не може нито да потвърди, нито да опровергае което и да е от двете проучвания с мозъчни митохондрии.

Матрица на условията

Четири причини и двете проучвания на комплекс III да са правилни за собствените си условия

1. Блокерът не представлява една и съща намеса. Само антимицин при 1 микрограм на ml срещу антимицин при 0.3 микромолара плюс отделен блокер на мястото Qo. Път на багрилото, който подава електрони към мястото Qo, не работи точно там, където пътят директно към цитохром c успява. Едно място не може да представлява и двете.

2. Дозата на багрилото и времето се различават. Основни концентрации от 1 срещу 2 микромолара при вещество с циклични окислително-редукционни реакции, чието натрупване и директна редукция на цитохром c зависят от концентрацията и времето. Малки разлики в дозата, съчетани с различен момент на измерване, могат да разкрият различни участъци от една и съща мрежа.

3. Препаратите се различават. Изолирането с дигитонин спрямо изолирането с градиент на Percoll подбира припокриващи се, но не идентични популации от митохондрии. Концентрацията на протеина съвпада — 0.1 mg на ml, така че тази променлива отпада, но субпопулацията и целостта не отпадат. А подозрението към вида е отхвърлено: втората група възпроизвежда своя фенотип и при мишки.

4. Субстратните условия определят какво може да направи багрилото. Три субстратни режима срещу двойки, свързани с NADH. Наличието на NADH и мембранният потенциал заедно определят колко бързо се редуцира багрилото и къде се разпределя, а път, който изисква редуцирано багрило в близост до окислен цитохром c, зависи от този избор.

Как да оцените следващото твърдение за заобикаляне

Попитайте кой комплекс е блокиран, с кой инхибитор, на кое място и при каква доза. Попитайте за концентрацията на багрилото и кога е направено измерването. Попитайте за тъканта, вида, изолирането, концентрацията на протеина и субстрата. Попитайте и дали потенциалът, дишането, редокс състоянието и директното измерване на предаването на електрони дават съгласувани резултати, защото тук потреблението на кислород само по себе си неведнъж насочва в погрешна посока.

Обобщението остава валидно в тесните си граници. Заобикалянето на комплекс I чрез багрилото е общоприето. При комплекс III миши митохондрии с антимицин при 1 микрограм на ml и багрило при 1 микромолар не показват функционално заобикаляне, докато три вида с антимицин при 0.3 микромолара или миксотиазол при 1 микромолар и багрило при 2 микромолара показват частично заобикаляне с директен пренос от багрилото към цитохром c. Тези твърдения могат да съществуват едновременно. Всичко по-широко е екстраполация.

Свързаните материали поставят спорното твърдение в рамките на безспорната химия: как метиленовото синьо пренася електрони за последователното предаване, експериментите за заобикаляне на комплекс I за установения случай в предходната част на веригата, измерванията на мембранния потенциал и техните артефакти за причината да са необходими две багрила, както и лабораторната работа с вещества с циклични окислително-редукционни реакции за капаните при дозата и времето.