Метиленово синьо при мозъчно увреждане: как да разбираме предклиничните доказателства

Удар по главата, запушена артерия и бавно протичащо невродегенеративно заболяване могат да доведат до един и същ проблем: мозъкът вече няма енергията, необходима за работата му. Този общ краен резултат обяснява защо едно съединение постоянно се появява в научната литература и за трите състояния. Но общият краен резултат не означава обща концепция. Лечение, приложено преди увреждането, лечение, приложено в рамките на час след него, и лечение, чиито резултати се измерват месеци по-късно, проверяват различни идеи, дори когато спринцовката съдържа една и съща синя течност.

Тази статия разглежда частта от литературата, посветена на уврежданията. Тя обобщава какво означава употребата на метиленово синьо при мозъчно увреждане в експерименти с животни, разграничава травматичното увреждане от инсулта и хроничната невродегенерация и показва защо моментът на приложение на дозата обяснява повечето разлики между проучванията.

Три увреждания, един енергиен срив

Механизмът, който свързва тези модели, се намира в митохондриите. Обикновено електроните преминават по електроннотранспортната верига, за да се произвежда ATP, а нормално функциониращата верига поддържа реактивните кислородни видове под контрол. След увреждане части от веригата започват да работят нарушено, производството на ATP намалява, а образуването на свободни радикали се увеличава. Обзорът в Molecular Neurobiology от 2018 г. описва метиленовото синьо като алтернативен преносител на електрони: то приема електрони от NADH и ги предава на цитохром c, което повишава активността на комплекс IV и възстановява синтеза на ATP дори когато началната част на веригата е нарушена.

Отчетените числа са конкретни. В клетъчни препарати и тъканни срезове активността на комплекс IV се повишава с 30 до 100 процента, а потреблението на кислород нараства успоредно с нея. Това показва, че допълнителните електрони извършват полезна работа, вместо да се отклоняват към образуване на радикали. В модел на инсулт при плъхове производството на ATP в засегнатата област е с около 30 процента по-високо 24 часа след лечението, отколкото при нелекуваните животни. Обзорът в Biochemistry (Moscow) от 2022 г. добавя последващите ефекти: по-малко оксидативен стрес, невровъзпаление и апоптоза, както и ефекти върху моноаминооксидазата, синтазата на азотен оксид, митохондриалната биогенеза, автофагията и агрегацията на неправилно нагънати белтъци.

Следователно концепцията е проста. Увреждането блокира нормалния път на електроните, а метиленовото синьо предлага обходен маршрут. Всичко по-нататък зависи от вида на увреждането, момента на приложение и начина на измерване.

Травматичното увреждане не е инсулт

В модел на травматично мозъчно увреждане силата действа изведнъж. Първичното увреждане е механично: тъканта се разкъсва, съдовете се пукат и кръвно-мозъчната бариера става пропусклива в рамките на минути. Това, върху което метиленовото синьо би могло да повлияе, е вторичната вълна през следващите часове и дни, когато митохондриите в оцелялата тъкан отказват, възпалението се разпространява и отокът нараства. Крайните показатели в тези проучвания отразяват тази последователност: обем на лезията, водно съдържание на мозъка, преживяемост на невроните около мястото на удара и по-късни поведенчески резултати, като двигателно възстановяване или научаване на маршрут в лабиринт.

В модел на инсулт или глобална исхемия увреждащото въздействие протича по противоположен начин. Кръвотокът спира, в рамките на минути настъпва енергиен срив, а възстановяването на кръвотока причинява собствено реперфузионно увреждане. Тук приложението се съобразява със съдовото събитие, често в рамките на минути след оклузията или реперфузията, а крайните показатели измерват какво се случва с тъканта в острия период — от часове до ден-два: размер на инфаркта, кръвоток и ранно функционално възстановяване. Един от подходите в литературата за инсулт е предварителното приложение: животните получават дозата преди оклузията на съда. Това проверява профилактиката по начин, който нито един експеримент с травма на главата не би могъл етично да възпроизведе при хора.

Резултатите при инсулт са най-убедителни в литературата за уврежданията, но сред тях е и най-ясният резултат без установен ефект. Плъхове, получили метиленово синьо при реперфузия след едночасова оклузия на средната мозъчна артерия, имат с 30 процента по-малки инфаркти на ден 2, като е запазена по-голяма част от застрашеното ядро и пенумбрата (Shen, 2013). Проучване с постоянна оклузия установява по-бавно преминаване на застрашената тъкан към инфаркт, но без намаление на крайния обем на инфаркта след 24 часа при нито една от двете изпитани дози (Rodriguez, 2014). Трето проучване с оклузия намалява размера на инфаркта приблизително наполовина при средната доза и пряко документира митохондриалната ултраструктура и митофагията в исхемичния мозък. Същевременно то съобщава и на пръв поглед нелогичната подробност, че измерената апоптоза се увеличава, докато некрозата намалява (Di, 2015). А при глобална исхемия непрекъснатата инфузия с ниска доза възстановява активността на цитохром c оксидазата, нивата на ATP и митохондриалния мембранен потенциал в уязвимата област CA1 на хипокампа, запазва тези неврони и предпазва пространствената памет (Lu, 2016). Това измерване в CA1 заслужава внимание: то предоставя преки данни за ATP и дихателната верига от увреден мозък — нещо, което литературата за TBI предимно извежда косвено, вместо да измерва.

Хроничната невродегенерация се различава и от двете. При модели на болестите на Алцхаймер, Паркинсон и Хънтингтън животните получават дози в продължение на седмици или месеци, а измерванията обхващат белтъчната агрегация, метаболизма и транспорта на допамина или постепенното влошаване на когнитивните функции. Тези крайни показатели почти нямат общо с лезия, измерена дни след удар. Читателите, които пренасят резултат от една категория в друга, прехвърлят находка през граница, която експериментите никога не са преминавали. Нашето ръководство за литературата за невродегенерацията разглежда тези дългосрочни проучвания в собствената им рамка, а сравнението с доказателствата само за инсулт подробно разграничава експериментите със съдово запушване от тези с удар.

Какво всъщност е направено в моделите на TBI

Няма публикувано изпитване на метиленово синьо при травматично мозъчно увреждане при хора. Всички данни за TBI идват от работа с животни, предимно плъхове и мишки, и се съсредоточават около малък набор от експерименти. Те заслужават да бъдат посочени поименно, защото се различават в подробности, които обобщенията заличават.

В най-ранното проучване с контролиран кортикален удар плъховете получават 1 mg/kg интравенозно един час след лек удар, а след това 0.5 mg/kg на третия час (Watts, 2014). Обемът на лезията, измерен с MRI, остава по-малък при лекуваните животни през двете седмици на проследяване. Грешките при стъпване в тест за ходене намаляват значимо на дни 1, 2 и 7, но не и на ден 14. При микроскопско изследване на ден 14 броят на дегенериращите неврони в увредената кора е 270 срещу 368 на зрително поле, а броят на тези с отклонения при оцветяване по Нисл е 41 срещу 73. С други думи, налице е ранна защита, но предимството в поведението отслабва до втората седмица.

Експеримент с дифузно увреждане използва течностна перкусия по средната линия при мишки и еднократна интравенозна доза от 2 mg/kg в рамките на половин час (Fenn, 2015). Лекуваните животни показват по-слабо изразена експресия на възпалителни гени, по-малко възпалително активирани микроглиални клетки, по-малко видим оток и липса на поведение, наподобяващо депресия, на ден 7. Резултатите без установен ефект са също толкова важни: самото увреждане повишава водното съдържание на мозъка само умерено, а метиленовото синьо не предотвратява загубата на телесно тегло или дефицита в двигателната координация. Противовъзпалителен ефект не означава пълна защита.

Две проучвания при мишки използват една и съща схема — 1 mg/kg на първия час, 0.5 mg/kg на шестия час, след това ежедневно приложение в продължение на три дни — и разширяват данните за механизма. В модел на кортикален удар лечението намалява обема на лезията на 24 часа, 72 часа и ден 14, като същевременно запазва невроните и повишава маркерите за автофагия (Zhao, 2016). В модел с течностна перкусия то намалява невронната апоптоза, ограничава повишената пропускливост на кръвно-мозъчната бариера и подобрява резултатите от неврологичните оценки в продължение на две седмици (Shen, 2019). В проучването на Zhao обаче водното съдържание на мозъка не показва разлика към 72 часа, а в проучването на Shen резултатите от теста с въртяща се пръчка не се различават на дни 1 и 3. Показателите за лезията и клетъчната преживяемост се променят; отокът и ранните двигателни показатели невинаги ги следват.

По отношение на времето се откроява експериментът с отложено приложение (Watts, 2016). При същия модел на удар първата доза е отложена до 24 часа след увреждането. Към ден 2 групата с отложено приложение показва намаления на лезията, сравними с тези при животните, лекувани през първите часове, като намалението се запазва на дни 7 и 14. Поведенческият сигнал е по-слаб: подобрението в грешките при стъпване в групата с отложено приложение е статистически незначима тенденция. Една лаборатория, един модел, един прозорец от 24 часа. Това е реално доказателство, че времевият прозорец се простира отвъд първите часове, но е и цялата доказателствена база за това твърдение. Обърнете внимание на капана в думата „отложена“ в други публикации: руска серия, чието заглавие се отнася до отложена неврозащита, прилага дозата на 30-ата минута и използва „отложена“ в смисъл на дълготрайни резултати, а не на късно начало на приложението.

По-малко проучване на фокално увреждане при плъхове допълва времевата картина от другата страна: и приложението непосредствено преди увреждането, и приложението 30 минути след него намаляват нарушенията във функцията на крайниците (Stelmashook, 2019). Предварителното приложение работи в лабораторията именно защото лабораторията определя кога ще настъпи увреждането.

Тук прецизността по отношение на дозата е важна. Обзорите описват ниските дози като стимулиращи митохондриалното дишане, а високите — като потискащи го. Това е същият двуфазен модел, който се наблюдава в цялата фармакология на метиленовото синьо. Ето защо резултатите не могат да се тълкуват като „повече синьо, повече възстановяване“. Всяко проучване изпитва една точка от кривата. Обяснението на зависимостта доза–отговор проследява тази крива в различни модели, а профилът на безопасност и нежелани реакции разглежда какво причиняват по-високите дози вместо това.

Прочетете таблицата по редове: едно и също съединение, три различни времеви рамки. Профилактиката принадлежи към средния ред, незабавното лечение — към първите два, а отдалечените във времето резултати — към първия и третия.

Профилактика, незабавно лечение, отдалечени във времето резултати

Твърдението за профилактика най-лесно може да бъде разбрано погрешно. В моделите на исхемия животните, получили доза преди съдовата оклузия, се справят по-добре. Този резултат понякога се цитира така, сякаш метиленовото синьо предпазва всеки мозък от всяко бъдещо увреждане. Той не показва нищо подобно. Показва, че митохондриите, предварително подготвени с алтернативен път за електроните, понасят по-добре предварително планирано прекъсване на кръвотока. Никой не планира травма на главата.

Доказателствата за TBI са съсредоточени върху незабавното лечение. Приложението в часовете след удара е насочено към каскадата на вторичното увреждане, докато тя все още се развива: енергиен срив, оксидативен стрес, възпаление, оток. Подобрението на показателите за лезията и отока тук представлява реален лечебен ефект, но това е лечение на процес, а не възстановяване на разкъсана тъкан.

Отдалечените във времето резултати са третата концепция. Поведението, измерено седмици след увреждането, или белтъчните процеси, измерени месеци след началото на дегенеративен модел, показват дали ранната защита се е запазила или дали бавните процеси са променили хода си. По-малка лезия на 24 часа, статистически незначима поведенческа тенденция след първа доза, отложена с 24 часа, и подобрение в лабиринт месеци след началото на продължително приложение са три различни твърдения с три различни изисквания за доказване. Засега само първото е покрило изискванията си повече от веднъж.

Какво тези доказателства не могат да покажат

Всеки резултат по-горе има едно и също ограничение. Митохондриите на гризачите реагират на метиленовото синьо по начини, които може да са общи с човешките митохондрии. Но плъх, получил интравенозна доза минути след прецизно калибриран удар, не е човек, пристигащ в спешно отделение часове след падане. Анестезията, контролираната тежест на увреждането, младите здрави животни и краткото проследяване ограничават преносимостта на резултатите. Изобщо няма проучване на метиленово синьо при увреждане от взрив, така че видът увреждане, най-значим за читателите от военната сфера, е този с най-малко доказателства.

Не се предлага и пренасяне на дозите към хора. В литературата за животни се използват интравенозни и интраперитонеални пътища на приложение с дози, избрани за експериментален контрол, а не капките за перорален прием, продавани на дребно. Нищо в тези проучвания не определя схема за приложение при хора и нищо тук не изпитва метиленово синьо наред със стандартните грижи при травма на главата.

Затова честното обобщение се побира в един абзац. При гризачи метиленовото синьо, приложено около момента на травматично или исхемично мозъчно увреждане, запазва митохондриалното производство на енергия. След това се наблюдават по-малки лезии и по-добри оценки на възстановяването. Едно проучване с удар запазва част от ефекта върху лезията при първа доза, отложена с 24 часа. Дали нещо от това се случва в увреден човешки мозък, не е изпитано, а литературата за TBI и тази за инсулта проверяват различни моменти на приложение спрямо различни крайни показатели. Всеки, който продава сигурност върху тези доказателства, добавя съставка, която експериментите никога не са съдържали.