Метиленово синьо и множествена склероза: какво проверяват изследванията при животни

Ако потърсите метиленово синьо при МС, ще намерите публикации, които сякаш отговарят на един и същ въпрос. Но не е така. В едното проучване метиленово синьо е давано на болни мишки като лечение. В другото нито едно животно не е лекувано с него. Метиленовото синьо е използвано като синьо багрило върху тънки срезове от гръбначния мозък, за да може патолог да види миелина под микроскоп.

Това е основната идея на цялата статия. Багрилото има две роли в биологията, които нямат нищо общо освен шишето. Като кандидат за лекарство то се прилага в определени дози на живо животно и въпросът е дали заболяването се променя. Като оцветител то се нанася върху мъртва, фиксирана тъкан след експеримента и въпросът е как е изглеждала тъканта. Ако пропуснете тази разлика, ще прочетете раздела с методите за патологично изследване така, сякаш представя резултат от лечение.

Какво е EAE, казано просто

Експерименталният автоимунен енцефаломиелит, обикновено съкращаван като EAE, е стандартният животински модел за отделни аспекти на множествената склероза. Изследовател имунизира предразположена мишка с фрагмент от миелинов белтък и силен адювант. След това имунната система атакува собствената централна нервна система на животното. Мишката развива възходяща слабост, която лесно се оценява по скала от 0 до 5 — от отпусната опашка до парализа на задните крайници.

Удобството на тази оценка обяснява защо EAE е популярен, но и защо може да подведе. МС при хората възниква спонтанно, включва по-широк и по-слабо определен набор от мишени и причинява зрителни, сетивни, когнитивни, малкомозъчни и двигателни симптоми с пристъпно или прогресиращо протичане. EAE възпроизвежда избрани механизми, като възпаление, демиелинизация и увреждане на аксоните, при контролирани условия. Той не възпроизвежда МС в миниатюра. Читателите, които искат общата рамка, могат да се запознаят с предполагаемото действие на метиленовото синьо на клетъчно ниво, преди да оценяват отделно твърдение за заболяване.

Двете публикации по-долу използват и различни антигени за EAE, което е важно. Терапевтичното проучване индуцира заболяването с MOG35-55 — кратък пептид от миелиновия олигодендроцитен гликопротеин. Патологичното проучване индуцира заболяването с MP4 — слят белтък от сегменти на миелиновия основен белтък и протеолипидния белтък. Изборът на щам и антиген променя къде се появяват лезиите и как протича възпалението, така че двете проучвания не са две повторения на един експеримент.

Картата: от модела през въпроса до ограниченията

Дръжте тази таблица отворена. Тя е основната справка за тази статия. Всеки ред посочва на кой клиничен въпрос може да отговори моделът, какво действително е измерено и докъде могат да се пренасят резултатите към хора.

Всеки, който проверява следващото заглавие, може да използва същите колони с помощта на как да четем предклинични проучвания: попитайте за вида животно и антигена, ролята на съединението, крайните показатели и дали резултатът отразява хода на заболяването, или състоянието на тъканта в определен момент.

Резултатът от лечението: какво се променя при прилагането

Терапевтичното проучване от 2016 г. в Journal of Neuroimmunology използва женски мишки C57BL/6 на възраст около 8 до 10 седмици, имунизирани с 250 микрограма MOG35-55 на мишка. След индуцирането животните с EAE са разпределени на случаен принцип в група с метиленово синьо или в нелекувана група с EAE, а клиничните оценки са проследени до около ден 30.

Клиничните оценки са значително по-ниски при лекуваните мишки, отколкото при контролните мишки с EAE, от ден 15 до ден 30, при P по-малко от 0.01. Анализът на гръбначния мозък показва същата посока на промяна: по-слаба възпалителна инфилтрация, по-малко демиелинизация и по-малка загуба на аксони при лекуваните животни.

Отличителната част е наборът от показатели за сигнализация. Лечението увеличава активирането на AMPK и експресията на SIRT1 и потиска активирането на NF-kB — централен регулатор на възпалението. В адаптивния имунитет то намалява Th17 отговора и засилва Treg отговора. Следователно предложената верига е: метиленово синьо, след това AMPK и SIRT1, по-слаба сигнализация чрез NF-kB, изместване от възпалителните Th17 към регулаторните Treg, по-леко тъканно увреждане и по-ниски оценки.

Тази верига е интерпретация, а не доказана причинно-следствена последователност. Проучването показва, че прилагането на веществото, промените в сигнализацията и подобрението на заболяването вървят заедно. То не доказва, че AMPK и SIRT1 обясняват цялата полза, а публично индексираният текст не представя точната доза в милиграми на килограм, начина на приложение, началния ден или продължителността достатъчно ясно, за да се възпроизведе схемата само от резюмето. Приемайте всяка стойност за дозиране, цитирана във връзка с тази публикация на търговска страница, като непроверена, освен ако не се позовава на методите в пълния текст. По-широката доказателствена база за метиленовото синьо при хора е мястото, където да проверите дали този ранен имунен сигнал някога е довел до клинични данни.

Патологичният резултат: какво показват тъканите за шест месеца

Проучването с MP4 от 2015 г. в PLoS ONE използва женски мишки C57BL/6, имунизирани с 200 микрограма MP4 в пълен адювант на Фройнд, плюс коклюшен токсин в деня на имунизацията и отново 48 часа по-късно. Нито едно животно не получава метиленово синьо като лекарство. След фиксиране и включване в среда напречни срезове от гръбначния мозък с дебелина един микрометър са оцветени с метиленово синьо за светлинна микроскопия, а вентролатералният тракт е изследван с електронна микроскопия за по-фини детайли.

Тъканни проби са взети на три етапа: в острия пик от 7 мишки, три месеца след началото от 5 мишки и шест месеца след началото от 10 мишки. Средните клинични оценки на тези етапи изглеждат почти еднакви — около 1.7 до 1.8 по скалата от 0 до 5. Тъканите показват различна картина. Изолираното миелиново увреждане нараства от около 569,000 влакна на квадратен милиметър в острия пик до около 1,496,000 на шестия месец, като сравнението между острия и дългосрочния етап е статистически значимо при P, равно на 0.027. Комбинираното увреждане на миелина и аксоните приблизително се удвоява до шестия месец. Влакната в процес на ремиелинизация остават под един процент на всеки етап — отрезвяващ детайл за надеждите за възстановяване.

Увреждането на аксоните следва U-образен модел: високо в острия пик, по-ниско на третия месец и най-високо на шестия месец. То корелира с набъбването на митохондриите и с намаленото разстояние между неврофиламентите. Оценяването е извършено без информация за клиничната оценка и етапа, което подкрепя извода, че клиничните оценки не отразяват напълно продължаващото структурно увреждане.

Това несъответствие е същинският принос на проучването за читателя, който се интересува от МС. Стабилната оценка на инвалидизацията не означава стабилно състояние на тъканите. То показва и защо тази публикация не може да подкрепи каквото и да е твърдение за лечение на МС с метиленово синьо. Тя изследва времето, а не лечението.

Защо нито едно проучване не установява полза при пациенти

Мислете за всяка публикация като за добър отговор на тесен въпрос, но не и като за отговор на въпроса за пациентите.

Първо, причината е различна. EAE се предизвиква умишлено с определен антиген и адювант. МС при хората се развива спонтанно с по-широк имунен репертоар, който включва T клетки, B клетки, вроден имунитет и резидентна глия. Съединение, което променя отговор, насочен предимно към MOG при мишка, не е задължително да промени този по-широк отговор при хората.

Второ, фенотипът е различен. Възходящата слабост от опашката към задните крайници при мишка е удобен показател. Тя свежда разнородността на МС при хората до една числова двигателна оценка. Лекарствата често променят краткосрочните оценки при EAE, без да променят хода на заболяването при хора, затова EAE е инструмент за скрининг и изследване на механизми, а не миниатюрна клиника.

Трето, експозицията и времето на приложение остават неизяснени. Продължителното прилагане от ранен етап в 30-дневен експеримент с мишки не е равнозначно на хроничен перорален прием при човек с вече установено заболяване, а нито едно от проучванията не измерва нивата на веществото в нервната система. Без тази връзка няма мост от концентрация в лабораторна плака или доза при мишка към схема за приложение при човек.

Четвърто, двете публикации не възпроизвеждат резултатите една на друга. Различни антигени, различни въпроси, различни крайни показатели и в единия случай — никакво лечение. Цитирането им заедно като две положителни проучвания за лечение на МС е грешка в категоризацията.

Какво означава това за читателите, които преценяват доказателствата

Тези публикации не установяват протокол за метиленово синьо при МС. Терапевтичното проучване подкрепя по-нататъшни изследвания върху AMPK, SIRT1, NF-kB и баланса между Th17 и Treg при MOG EAE. Патологичното проучване напомня, че тъканното увреждане може да напредва, докато оценките изглеждат непроменени, и че метиленовото синьо в раздела с методите понякога означава съд с оцветител, а не шкаф с лекарства. Читателите, които следят текущите изследвания на множествената склероза, трябва да имат предвид тази разлика между оцветител и лекарство. Въпросите за безопасността, включително рисковете за кръвта и рисковете от взаимодействия, трябва да се обсъждат с лекар наред с общите данни за безопасността на метиленовото синьо, преди някой да предприеме действия въз основа на заглавия за лабораторни резултати.

Основният извод се побира в едно изречение. Едното цитирано проучване прилага метиленово синьо на мишки с MOG EAE и отчита по-леко заболяване с противовъзпалителна промяна в имунния отговор, докато другото цитирано проучване не прилага никакво лечение и използва метиленово синьо само за оцветяване на гръбначния мозък, като документира шест месеца на натрупващо се увреждане на миелина и аксоните, така че двете заедно не установяват, че метиленовото синьо помага при МС при хората.