Метиленово синьо и фероптоза: желязо, липидна пероксидация и клетъчна смърт

Фероптозата е клетъчна смърт вследствие на увреждане на мембраната. Полиненаситените мазнини в мембраните се окисляват във верижна реакция, мембраната губи целостта си и клетката умира. За тези химични процеси е необходимо желязо. Това изречение обобщава цялата концепция, а всичко в тази статия представлява проверка на отделна част от нея.

Въпросът тук е по-тесен: какво прави метиленовото синьо с тази верига в клетъчни експерименти и какво всъщност показва резултатът. Краткият отговор е, че в две лабораторни изследвания метиленовото синьо в наномоларни концентрации намалява митохондриалната липидна пероксидация и запазва клетките живи след въздействия, които иначе предизвикват фероптоза. По-дългият отговор е по-важен, защото всяко звено от веригата е проверено чрез различна намеса, а всяка намеса има ограничения.

Фероптозата в един абзац

Мембранният фосфолипид с опашка от полиненаситена мастна киселина има слабо място: водородни атоми, които лесно могат да бъдат отнети. Щом радикал отнеме един от тях, към липида се присъединява кислород, образува се липиден пероксилен радикал и той отнема водород от следващия липид. Реакцията се разпространява по мембраната, освен ако нещо не я спре.

Основният механизъм за спиране е ензимът GPX4, който използва глутатион, за да редуцира липидните пероксиди до безвредни липидни алкохоли. Лабораторните индуктори атакуват тази защита в определени точки. Ерастинът блокира вноса на цистин чрез системата xc-minus, което лишава клетката от цистеин за синтеза на глутатион. Бутионин сулфоксиминът блокира директно синтеза на глутатион. RSL3 инхибира самия GPX4. И трите оставят пероксидите неотстранени, но действат на различни етапи, така че резултатът с един индуктор не може автоматично да се обобщи за останалите.

Фероптозата се различава от апоптозата по определящите я характеристики. Няма каспазна каскада и няма апоптотични телца. Железни хелатори като дефероксамин и вещества, улавящи радикали, като феростатин-1 я потискат. Това е практическата проверка, която изследователите използват, за да определят клетъчната смърт като фероптотична, а не просто некротична. По-широката картина на пътищата на регулирана клетъчна смърт поставя това разграничение в контекст, а начинът, по който клетките управляват лабилното желязо, обяснява защо хелацията е толкова решаваща контролна проверка.

Къде се вписват митохондриите и защо това е било спорно

Ранни изследвания съобщават, че клетки без митохондриална ДНК също претърпяват фероптоза, което подсказва, че митохондриите не са задължителни. По-късни изследвания установяват, че намаляването на броя на митохондриите или блокирането на дишането може да потисне фероптозата при недостиг на цистеин, но не и при директно инхибиране на GPX4. И двата резултата могат да бъдат верни, ако приносът на митохондриите зависи от индуктора, типа клетка и мястото, където протича решаващата пероксидация.

Изследването, на което се основава тази статия, разглежда спора със сонда, специфична за определен клетъчен компартмент. MitoCLox е насочена към митохондриите версия на индикатор за липидна пероксидация: флуоресценцията му се променя при среща с липидни пероксилни радикали вътре в митохондриите. Във фибробласти, третирани с ерастин, окисляването на митохондриалната сонда се появява във все още живи клетки преди смъртта и е нееднородно в клетъчната популация. Тази последователност във времето е важна. Пероксидацията, която предхожда смъртта, е възможна причина. Пероксидацията, измерена само в мъртви клетки, е сигнал от клетъчни остатъци. Съпътстващото ръководство за методите за измерване на липидната пероксидация и какво отчита всяка сонда обяснява защо местоположението на сондата определя значението на сигнала.

Същият модел се наблюдава и във втори модел. Фибробласти от пациент с наследствена оптична невропатия на Лебер, които носят мутация в комплекс I и имат по-висок изходен оксидативен стрес, загиват чрез фероптоза при изчерпване на глутатиона, докато контролните фибробласти устояват. Окисляването на митохондриалната сонда отново се появява първо. Подробностите са в изследването на митохондриалната липидна пероксидация при фероптоза във фибробласти.

Какво променя метиленовото синьо в тези експерименти

Метиленовото синьо е редокс преносител. Окислената му форма приема електрони от свързаните с NADH химични процеси в комплекс I, а редуцираната му форма ги отдава на цитохром c, който ги подава към комплекс IV. Това създава частичен обходен път около участъка от веригата, където електроните обикновено изтичат към кислорода и образуват супероксид. Читателите, които искат пълната картина на преноса, могат да започнат с начина, по който метиленовото синьо пренася електрони през митохондриите.

В белодробни фибробласти, третирани с ерастин, метиленовото синьо при концентрация от 250 наномолара запазва жизнеспособността, отчетена чрез тест за клетъчно оцеляване, наред с насочените към митохондриите антиоксиданти SkQ1 и MitoTEMPO. Контролните условия определят границите на извода. Феростатин-1, алфа-токоферолът и дефероксаминът също осигуряват защита, което потвърждава, че смъртта е фероптотична. Аналогът на SkQ1 без антиоксидантна група не осигурява защита, което насочва към редокс химията, а не към неспецифично натрупване. Защитата отслабва над приблизително 200 наномолара SkQ1, в съответствие с познатото прооксидантно поведение на хиноновите антиоксиданти при по-високи концентрации. Метиленовото синьо има същото двояко, зависимо от дозата поведение: защитно при ниски наномоларни концентрации в тези култури и способно да образува водороден пероксид чрез редокс циклиране при по-високи концентрации или силно осветяване. Такъв контекст на дозата е разгледан в реактивните кислородни видове в митохондриите.

След това експериментите с изолирани митохондрии разграничават източниците на реактивни кислородни видове. В присъствието на двувалентно желязо субстрати, подаващи електрони към комплекс I, заедно с ротенон стимулират окисляването на сондата. Ротенонът блокира преноса след флавиновия център, така че преносителите преди него остават редуцирани и електрони изтичат към кислорода от флавина, ориентиран към матрикса. Субстрати, подаващи електрони към комплекс III, заедно с антимицин A образуват голямо количество водороден пероксид, но не предизвикват липидна пероксидация. Един и същ общ сигнал за реактивни кислородни видове, различно местоположение, различен резултат. И SkQ1, и метиленовото синьо потискат пероксидацията, предизвикана от комплекс I, без да потискат самото образуване на водороден пероксид. Това поставя действието им след образуването на реактивните кислородни видове, на етапа на липидната пероксидация.

Експериментите с претоварване с желязо и следата от липофусцина

Второ изследване разглежда въпроса от страната на желязото. Кардиомиоцити H9c2, изложени на субмилимоларни концентрации на железен(III) амониев цитрат, развиват митохондриални реактивни кислородни видове, митохондриална липидна пероксидация, а след това фероптоза, последвана от натрупване на липофусциноподобен пигмент в рамките на 24 часа. Липофусцинът е автофлуоресцентният, съдържащ желязо остатък от окислени липиди и белтъци, който се натрупва с възрастта. Бързата му поява тук свързва острата пероксидация, предизвикана от желязо, с класически маркер на стареенето. И метиленовото синьо в наномоларни концентрации, и SkQ1 предотвратяват пероксидацията, смъртта и натрупването на пигмента. Изолирани сърдечни митохондрии потвърждават модела: ротенонът заедно с двувалентно желязо предизвиква пероксидация и сигнал, подобен на този от пигмент, а и двете вещества го блокират. Пълната последователност е описана в изследването на претоварването с желязо в кардиомиоцити H9c2. Частта за пигмента е свързана с темата за липофусцина и маркерите на клетъчното стареене.

Какво не показват тестовете за клетъчно оцеляване

Тест за жизнеспособност като CellTiterBlue отчита колко клетки в културата остават метаболитно активни след въздействие на индуктор и потенциално защитно вещество. Това е проверка на механизъм в определена система. Не е резултат от лечение. В нито един от тези експерименти не е прилагана доза на пациент, не е измерван краен показател за заболяване и не е установен терапевтичен прозорец в организъм.

Четири ограничения заслужават изрично посочване. Първо, наборът от клетъчни типове е тесен: трансформирани белодробни фибробласти, първични кожни фибробласти, включително една линия с митохондриално заболяване, и линия от кардиомиоцити на плъх, както и изолирани митохондрии от сърце на плъх. Чувствителността варира между линиите, а линията с LHON е подбрана именно заради необичайно високата си уязвимост. Второ, индукторите представляват крайни лабораторни условия: пълно блокиране на транспорта или синтеза и натоварване с желязо, на което никоя тъкан не би била изложена остро. Трето, концентрацията не може да се преобразува чрез умножение. Наномоларната концентрация в хранителна среда не е доза за човек, а разпределението на метиленовото синьо, редукцията му до безцветната форма в кръвта и тъканите, излагането на светлина и мембранният потенциал са все фактори между клетъчната култура и човека. Четвърто, сондите отчитат случващото се в собствения им компартмент. Окисляването на MitoCLox показва, че са се образували митохондриални липидни радикали; то не показва дали разкъсването на плазмената мембрана, вероятното крайно събитие, е предотвратено пряко, или е избегнато чрез намеса на по-ранен етап.

Затова коректният извод е следният: в тези модели реактивните кислородни видове от комплекс I заедно с желязото предизвикват митохондриална липидна пероксидация, която предхожда фероптозата, а метиленовото синьо при ниски концентрации прекъсва този участък от процеса. Всичко отвъд този участък изисква други експерименти — първо при животни, а след това при хора.