Паўль Эрліх і метыленавы сіні: як фарбавальнік дапамог сфармаваць падыход да распрацоўкі лекаў

Унёсак Паўля Эрліха ў медыцыну быў не лекам. Ён быў разважаннем пра тое, як трэба разглядаць лекі.

У 1878 годзе ён падаў доктарскую дысертацыю, пачатковы раздзел якой называўся «Хімічнае разуменне афарбоўвання». Яе асноўная думка палягала ў тым, што афарбоўванне зрэзу тканкі і фарбаванне кавалка палатна падпарадкоўваюцца адной логіцы. У абодвух выпадках колер замацоўваецца дзякуючы хімічнаму сродству паміж фарбавальнікам і матэрыялам, а не таму, што тканка ўбірае рэчывы, утрымлівае тлушч або мае форму, здольную затрымаць пігмент. У дзяцінстве Эрліх назіраў, як яго стрыечны брат, патолаг Карл Вайгерт, рыхтуе афарбаваныя зрэзы. Яго ўвагу прыцягвалі не выявы, а сам факт таго, што фарбавальнік выбірае, куды трапіць.

Гэтае сцвярджэнне здаецца сціплым. Але гэта не так. Калі фарбавальнік звязваецца з тканкай з хімічных прычын, то карціна афарбоўвання паведамляе пра хімію гэтай тканкі. Афарбаваны мікрапрэпарат перастае быць ілюстрацыяй і становіцца вымярэннем.

Ён адразу развіў гэтую ідэю. У 1880 годзе ён спалучыў метыленавы сіні з кіслым фуксінам і назваў сумесь нейтральным фарбавальнікам, нейтральным фарбавальным рэчывам. Яна дазваляла адрозніваць тыпы лейкацытаў там, дзе асобныя фарбавальнікі, якія тады выкарыстоўваліся, гэтага не дазвалялі. Праз два гады ён прадставіў метад афарбоўвання туберкулёзных бацыл метылавым фіялетавым, і Кох пачаў выкарыстоўваць яго ў сваёй працы.

Тэорыя, якая пазней дала гэтым практыкам агульную аснову, — асобная гісторыя, і яе храналогію часта спрашчаюць. Тэорыя бакавых ланцугоў Эрліха — ідэя, што рэчыва дзейнічае на клетку таму, што яны хімічна сумяшчальныя, — адносіцца да 1890-х гадоў, а не да перыяду эксперыментаў з фарбавальнікамі. Ранейшая праца дала зыходнае перакананне: выбіральнасць мае хімічную прыроду, а значыць, яе можна мэтанакіравана шукаць, а не выпадкова знаходзіць.

Эксперымент, які ператварыў фарбавальнік у карту

У 1885 годзе Эрліх апублікаваў манаграфію пра патрэбы арганізма ў кіслародзе з падзагалоўкам, які характарызаваў яе як колерааналітычнае даследаванне. Метад заключаўся ва ўвядзенні фарбавальнікаў, колер якіх залежыць ад ступені акіслення, і наступным параўнанні таго, як розныя органы аднаўлялі іх або захоўвалі нязменнымі. Фарбавальнік выкарыстоўваўся як прыбор — падобна да тэрмометра: ён паведамляў пра ўмовы ўнутры тканкі, якія нельга было даследаваць непасрэдна. Сам Эрліх фармуляваў мэту як вызначэнне аднаўляльнай здольнасці жывых органаў з дапамогай пэўных фарбавальнікаў.

Вынік з метыленавым сінім з'явіўся ў 1886 годзе ў артыкуле пра рэакцыю фарбавальніка з жывой нервовай тканкай, які быў зачытаны ў медыцынскім таварыстве ў снежні папярэдняга года. Метыленавы сіні ўводзілі ў крывацёк жывой жывёлы, пасля чаго бралі тонкія зрэзы тканкі і пакідалі іх на паветры, каб назапашаны бясколерны фарбавальнік акісліўся, зноў стаў сінім і паказаў, дзе ён сабраўся. Нервовыя клеткі і нервовыя валокны афарбоўваліся, прычым дастаткова выбіральна, каб гэтая тэхніка стала стандартным метадам выяўлення нервовай тканкі. Злучэнне ўжо не было проста фарбавальным рэчывам, нанесеным на мёртвы зрэз на лабараторным стале. Яно стала маркерам, які сам размяркоўваўся ўнутры жывога арганізма, і гэтае размеркаванне можна было прачытаць.

Уласцівасць, на якой грунтаваліся абодва эксперыменты, варта назваць выразна, бо ад яе залежыць усё астатняе ў гэтай гісторыі. Метыленавы сіні здольны да зварачальных пераўтварэнняў. Яго адноўленая форма, лейкаметыленавы сіні, бясколерная, а пры кантакце з кіслародам яна зноў ператвараецца ў сіні катыён. Раствор фарбавальніка з глюкозай у герметычна закрытай банцы бясколерны; калі адкрыць банку, ён становіцца сінім. Паводле паведамленняў, Эрліх дэманстраваў гэта непасрэдна: апрацоўваў афарбаваныя зрэзы хларыдам жалеза, а таксама паветрам і назіраў вяртанне колеру. Фарбавальнік, які змяняе колер у залежнасці ад акісляльна-аднаўленчага стану асяроддзя, служыць зондам для гэтага асяроддзя.

Так побач апынуліся дзве ўласцівасці. Фарбавальнік мог адрозніваць адну тканку ад іншай. І фарбавальнік можна было ўключаць і выключаць, змяняючы ступень акіслення.

Калі азірнуцца назад, другая ўласцівасць — гэта пачатак хіміятэрапіі. Калі злучэнне звязваецца з адным тыпам тканкі, але не з іншым, то тое самае злучэнне можа дасягаць аднаго віду арганізма, але не іншага. Эрліх сфармуляваў выснову непасрэдна: калі патаген можна выбіральна афарбаваць, афарбоўванне можа ўказваць на спецыфічнае пашкоджанне гэтага патагена. Такім чынам, фарбавальнік можна было б выкарыстоўваць як лекі, накіраваныя на чужародны арганізм, а не на пацыента.

Першае выпрабаванне на пацыенце не датычылася малярыі. У 1890 годзе Эрліх разам з псіхіятрам Артурам Лепманам паведаміў, што метыленавы сіні палягчаў боль пры неўралгічных і рэўматычных станах мышцаў, суставаў і сухажылляў. Яны абмеркавалі, ці можа прэпарат дзейнічаць пры псіхічных захворваннях, і вырашылі не спрабаваць. Італьянскі лекар П'етра Бадоні з Генуі ўсё ж пайшоў далей. Назва яго артыкула 1899 года прысвечана седатыўнаму дзеянню пры розных формах псіхозу: ён апісаў заспакаенне чатырнаццаці ўзбуджаных пацыентаў і адзначыў, што іншыя генуэзскія лекары ўжо выкарыстоўвалі фарбавальнік з той жа мэтай. Седатыўны эфект — не тое самае, што ўздзеянне на захворванне, і гэтае адрозненне зноў і зноў узнікае ў гэтай гісторыі.

Праца з малярыяй пачалася ў 1891 годзе разам з патолагам Паўлем Гутманам у бальніцы Маабіт у Берліне. Метыленавы сіні далі двум пацыентам, а справаздача з'явілася ў Berliner klinische Wochenschrift за 28 верасня 1891 года. У першым выпадку пацыент прыняў адразу 0.5 g фарбавальніка ўвечары 29 чэрвеня; чаканы прыступ не развіўся цалкам, а адзінай зафіксаванай пасля скаргай была лёгкая странгурыя з сіняй мачой. Прыступы ліхаманкі зніклі ў першыя дні, а паразіты зніклі з крыві не пазней за восьмы дзень. Самі аўтары падсумавалі, што іх чаканні цалкам спраўдзіліся. Два выпадкі без кантролю не з'яўляюцца доказам. Больш поўны агляд тэмы метыленавага сіняга і малярыі, уключаючы сучасныя выпрабаванні, вынесены на асобную старонку. Тут жа цікавае больш вузкае пытанне: якая частка разважанняў Эрліха вытрымала сустрэчу з паразітам.

Дзе разважанні спрацавалі, а дзе — не

Ад прапанаванага механізму захавалася няшмат, прынамсі ў той форме, якую прапаноўваў Эрліх. Акуратная версія, у якой плоскі трыцыклічны катыён праслізгвае паміж парамі асноў ДНК паразіта, не вытрымлівае праверкі на Plasmodium. Метыленавы сіні настолькі лёгка аднаўляецца ў інфіцыраваным эрытрацыце, што наогул не дасягае паразіта ў выглядзе плоскага катыёна, і тлумачэнне праз інтэркаляцыю, якое пасуе акрыдынавым фарбавальнікам, не пасуе гэтаму.

Карціна, якую падтрымліваюць дадзеныя, менш упарадкаваная. Метыленавы сіні інгібіруе глутатыёнрэдуктазу паразіта пры канцэнтрацыях, якія могуць быць дасягнуты ў пацыента. Ён блакуе пераўтварэнне гему ў гемазаін — інертны пігмент, які паразіт утварае, каб пазбегнуць атручвання прадуктамі ўласнага ператраўлівання гемаглабіну, — прыкладна гэтак жа эфектыўна, як хлорахін, і значна больш эфектыўна, чым хінін. Яго акісляльна-аднаўленчы цыкл таксама стварае актыўныя формы кіслароду ў клетцы, якая ўжо іх выпрацоўвае. Які з гэтых механізмаў сапраўдны, ці ўсе яны робяць свой унёсак, дагэтуль не высветлена.

Ёсць і яшчэ адно ўскладненне, якое варта ўлічваць пры чытанні любых гістарычных сцвярджэнняў пра гэтае злучэнне. Камерцыйны метыленавы сіні таго часу не быў адным рэчывам. Узоры ўтрымлівалі azure B, мона-дэметыляваны аналаг, а ў старых растворах яго назапашвалася больш. Azure B — метахраматычны фарбавальнік з іншымі мішэнямі: ён афарбоўвае двухланцуговую ДНК у насычаны сіні колер, а РНК — у зялёны. Сумесь двух фарбавальнікаў, якія трапляюць у розныя месцы, у прапорцыях, якіх ніхто не запісваў, не дазваляе дакладна сцвярджаць, што менавіта рабіў метыленавы сіні ў яе складзе.

Сам фарбавальнік так і не выцесніў хінін. Метад меў большы поспех. Вучань Эрліха Вільгельм Рэль, які працаваў у аб'яднанні вытворцаў фарбавальнікаў і лекаў IG Farben, працягваў прасоўваць вытворныя фарбавальнікаў як лекі ад трапічных хвароб і даў інструмент, якога не хапала: канарэйку, заражаную птушынай малярыяй, як стандартную мадэль для скрынінгу злучэнняў-кандыдатаў. Затым Вернер Шулеман змяніў бакавы ланцуг, і атрыманая соль фенатыязінію вылечыла эксперыментальную інфекцыю. Яна па-ранейшаму рабіла пацыентаў сінімі.

Устойлівым вынікам аказаўся не фарбавальнік і не сістэма кольцаў, а бакавы ланцуг. Даданне дыялкіламінаалкіламінагрупы змяніла паводзіны малекулы, і гэты фрагмент захаваўся пры ўсіх наступных перапрацоўках структуры. Калі пакінуць гэтую групу і замяніць фенатыязініевае кольца на акрыдынавае, атрымаецца хінакрын. Калі ўставіць хіналінавае — хлорахін. Памахін, прымахін і амадыяхін, якія дагэтуль уваходзяць у пералік супрацьмалярыйных прэпаратаў, маюць тую самую групу. Злучэнне, якое не мела поспеху як сродак лячэння, дало фрагмент, які аказаўся паспяховым.

Сувязь з антыпсіхатычнымі прэпаратамі праходзіць праз кольца, а не праз лекі. Менавіта высвятленне структуры метыленавага сіняга прывяло Генрыха Аўгуста Бернтсена да зыходнага фенатыязінавага ядра ў 1883 годзе. Над гэтым каркасам з рознымі замяшчальнікамі працавалі хімікі Rhône-Poulenc у 1940-х гадах, шукаючы антыгістамінныя сродкі. Адно з гэтых злучэнняў сінтэзавалі прыкладна ў канцы 1950 года і выпрабавалі хірургам Анры Лабары, які заўважыў, што яно рабіла пацыентаў спакойнымі і абыякавымі. Першае апублікаванае паведамленне пра яго прымяненне ў псіхіятрыі, у пацыента з маніяй, з'явілася ў студзені 1952 года. Першы антыпсіхатычны прэпарат — не столькі нашчадак супрацьмалярыйнага сродку Эрліха, колькі далёкі сваяк фарбавальніка, з якога ён пачаў.

Тры звычкі, якія варта вынесці з гэтай гісторыі

1. «Першы сінтэтычны прэпарат, выкарыстаны ў медыцыне» апісвае катэгорыю, а агаворак тут больш, чым падказвае сама фраза. Гэтая фраза стала звыклай; часта цытаваны агляд Шырмера і калег у Neurobiology of Aging называе метыленавы сіні самым першым цалкам сінтэтычным прэпаратам, выкарыстаным у медыцыне. Хлоралгідрат пачалі выкарыстоўваць як сінтэтычны седатыўны сродак у 1869 годзе, больш чым на дваццаць гадоў раней. Сам артыкул 1891 года дае частку адказу, бо яго аўтары называюць сінтэтычныя гарачкапаніжальныя сродкі, якія ўжо аказаліся няўдалымі супраць малярыі, сярод іх хіналін, антыпірын і антыфебрын. Уласны мыш'яковы прэпарат Эрліха супраць сіфілісу з'явіўся яшчэ пазней. Абгрунтаваная версія гэтага сцвярджэння датычыцца метаду, а не першынства: метыленавы сіні — адно з самых ранніх сінтэтычных злучэнняў, выбраных для ўздзеяння на канкрэтны арганізм на падставе хімічнай тэорыі выбіральнасці.
2. Выбіральнае размеркаванне не азначае выбіральнай карысці. Вынік Эрліха 1886 года паказаў, што фарбавальнік трапляе ў нервовую тканку. Куды трапляе злучэнне і што яно там робіць — гэта два розныя вымярэнні, і першае выканаць значна лягчэй. Менавіта ў гэтым разрыве з таго часу існуе большасць сцвярджэнняў пра метыленавы сіні і мозг.
3. Чысціня належыць да доказнай базы, а не да маркетынгу. Гістарычныя звесткі неадназначныя менавіта з гэтай прычыны. Невялікія структурныя адрозненні змяняюць тое, куды трапляе гэтае злучэнне. Таму сертыфікат аналізу павінен быць прывязаны да канкрэтнай партыі, а не прапаноўвацца як агульнае сцвярджэнне, што прадукт правераны. Прадавец, які заяўляе пра адпаведнасць фармакапейнай манаграфіі, але правярае толькі цяжкія металы, сцвярджае больш, чым пацвярджае пратакол. Blupreme атрымлівае метыленавы сіні ад фармацэўтычнага вытворцы і правярае поўную спецыфікацыю, выкладзеную ў манаграфіі: ідэнтычнасць, чысціню, арганічныя прымесі, рэшткавыя растваральнікі, элементныя прымесі, астатак пасля пракальвання, мікрабіялагічныя межы і бактэрыяльныя эндатаксіны. Пратакол публікуецца разам з прадуктам, а старонка пра метыленавы сіні якасці USP тлумачыць гэтыя межы і тое, чаму вынік для azure B варта шукаць першым.

Храналогія крыніц

Храналагічная паслядоўнасць ключавых этапаў, уключаючы хімію фарбавальнікаў да Эрліха і класы якасці ды спецыфікацыі пасля яго, асобна выкладзена ў гісторыі метыленавага сіняга, а сутнасць самога злучэння разглядаецца ў матэрыяле пра тое, што такое метыленавы сіні.

Ілюстрацыі, на якіх грунтуецца гэты аповед і якія ўзноўлены ў аглядзе Крафтс, Хемпельмана і Скурскай-Стані 2012 года, не раўназначныя, і адзін прыклад паказвае чаму. Ілюстрацыя 1891 года — першаснае сведчанне выпрабавання; партрэт 1910 года побач з ёй датуе рэпутацыю і нічога больш. Старонкі з нататніка Андэрзага 1934 года — непасрэдны след хіналінавага замяшчэння, запісаны рукой самога хіміка.

Сумленнае падсумаванне эксперыментаў Эрліха з фарбавальнікамі такое: ён правільна вызначыў выбіральнасць і мішэнь, але памыліўся з механізмам. Метыленавы сіні сапраўды канцэнтруецца ў нервовай тканцы і сапраўды шкодзіць малярыйнаму паразіту. Другое адбываецца не праз першае, і хімічнае тлумачэнне, якое ён прапанаваў для абодвух, было памылковым. Тое, што ён бясспрэчна прадэманстраваў, аказалася больш трывалым за правільны механізм: злучэнне можна выбраць, а не проста знайсці, прычым выбраць на падставе дадзеных, сабраных яшчэ да таго, як яго дадуць пацыенту.