Як метыленавы сіні трапляе ў клеткі: аднаўленне, паўторнае акісленне, паглынанне

Калі назіраць, як эндатэліяльныя клеткі ў культуральнай чашцы паглынаюць метыленавы сіні, відавочная інтэрпрэтацыя будзе памылковай. Асяроддзе губляе сіні колер, у клетках з'яўляюцца сінія гранулы — значыць, фарбавальнік мусіў прайсці праз мембрану ў выглядзе сіняй малекулы. Эксперыменты сведчаць пра іншае. Сіняя форма амаль не праходзіць праз мембрану. Праходзіць бясколерная форма, а сіні колер, які вы бачыце ўнутры, утвараецца ўжо там, пасля пранікнення.

Гэтая змена погляду важная, бо яна вызначае, пра што афарбоўванне можа і не можа сведчыць. Сінія гранулы паказваюць акіслены фарбавальнік, які быў паўторна акіслены і затрыманы ў арганэлах. Яны не паказваюць агульную колькасць фарбавальніка ў клетцы, не адлюстроўваюць яго адноўлены пул і не вымяраюць біялагічны эфект. Каб зразумець чаму, прасачыце тры этапы: аднаўленне на паверхні, дыфузію адноўленай формы, паўторнае акісленне і затрымліванне ўнутры.

Дзве формы паводзяць сябе як розныя малекулы

Акіслены метыленавы сіні — гэта плоская кальцавая сістэма з дадатным зарадам. Ён раствараецца ў вадзе, інтэнсіўна паглынае святло ў дыяпазоне прыкладна ад 600 да 700 нанаметраў і выглядае сінім. Ключавое тут — зарад. Зараджаная гідрафільная малекула не можа лёгка прайсці праз ліпідную мембрану, таму ў літаратуры асцярожна кажуць пра адносную, а не абсалютную непранікальнасць мембраны для яе.

Адноўлены метыленавы сіні, які называюць лейкаметыленавым сінім, бясколерны, не мае зараду і раствараецца ў тлушчах. Прыбярыце зарад — і мембрана перастане быць сцяной. Адноўленая малекула лёгка дыфундуе праз яе, а трапіўшы ў адсек з больш акісляльным асяроддзем, можа зноў страціць электроны і вярнуцца ў сінюю, зараджаную форму, якая затрымліваецца ўнутры. Таму акісляльна-аднаўленчая хімія фарбавальніка адначасова з'яўляецца механізмам яго транспарту. Змяняючы колькасць электронаў, вы змяняеце пранікальнасць.

Электроны для першага этапу пастаўляе сама клетка. Клеткі млекакормячых пераносяць электроны праз плазматычную мембрану, накіроўваючы аднаўленчыя эквіваленты ад унутрыклетачных донараў вонкі, да акцэптараў на паверхні. Гэтая актыўнасць праз плазматычную мембрану — нармальная функцыя клетак, уласцівая большасці іх тыпаў. Паверхневая рэдуктаза эндатэлію, якая ўзаемадзейнічае з тыязінавымі фарбавальнікамі, у адным паказальным аспекце паводзіць сябе як іншыя рэдуктазы: яна працягвае працаваць у прысутнасці цыяніду і азіду ў дозах, якія блакуюць пазнейшыя этапы. Гэтае раздзяленне этапаў — ключ да ўсёй гісторыі.

Спачатку было размеркаванне паміж фазамі, і яно амаль патлумачыла паглынанне

У 1929 годзе Марыян Ірвін з Інстытута Ракфелера паставіла больш простае пытанне. Магчыма, пранікненне фарбавальніка — гэта проста яго размеркаванне паміж вадой і тлушчавымі пластамі клеткі, а ў лабараторным доследзе гэтыя пласты можна замяніць пластом хлараформу. У сваіх спектрафатаметрычных даследаваннях пранікнення яна ўзбоўтвала водныя растворы фарбавальнікаў з хлараформам і параўноўвала тое, што пераходзіла ў арганічную фазу, з тым, што трапляла ў жывыя клеткі водарасцей.

Дзве высновы з гэтай працы па-ранейшаму заслугоўваюць увагі. Па-першае, камерцыйныя растворы метыленавага сіняга ўтрымлівалі трыметылтыянін, які цяпер называюць Azure B, і гэтая прымесь пранікала хутчэй за сам метыленавы сіні, асабліва пры шчолачным pH, калі пераважае тлушчарастваральная форма свабоднай асновы. Частка таго, што выглядала як пранікненне метыленавага сіняга, насамрэч была выбарачным пранікненнем Azure B. Па-другое, pH вызначаў вынік праз стан іанізацыі, а пашкоджаныя клеткі прапускалі значна больш фарбавальніка, чым непашкоджаныя. Каэфіцыенты размеркавання і зарад вызначалі, што паглыналі штучная сістэма і жывая клетка, а падабенства паміж імі падтрымлівала ўяўленне пра неводныя пласты на мяжы клеткі.

Мадэль апярэджвала свой час у разуменні ролі ліпідаў і іанізацыі, але не магла адрозніць фарбавальнік, які размяркоўваецца паміж фазамі без зменаў, ад фарбавальніка, які хімічна ператвараецца на паверхні, перасякае мембрану ў іншым выглядзе і ператвараецца назад унутры. Для гэтага быў патрэбны іншы эксперымент, які правялі праз семдзесят гадоў на эндатэліі лёгкіх.

Аднаўленне звонку, затрымліванне ўнутры

Меркер і калегі працавалі з культываванымі эндатэліяльнымі клеткамі лёгачнай артэрыі буйной рагатай жывёлы і прапанавалі трохэтапную паслядоўнасць: акіслены фарбавальнік аднаўляецца на паверхні клеткі да сваёй бясколернай ліпафільнай формы, адноўленая форма дыфундуе ўнутр, а ўнутрыклетачнае паўторнае акісленне зноў утварае акісленую форму, якая не праходзіць праз мембрану і назапашваецца. Затым у сваім даследаванні паглынання тыязінавых фарбавальнікаў эндатэліем яны праверылі гэтую паслядоўнасць, спрабуючы перапыніць яе ў пэўных месцах.

Першым інструментам стаў ферыцыянід — акцэптар электронаў, які не можа трапіць у клетку. Калі паверхневыя ферменты аднаўляюць сіні фарбавальнік да бясколернай формы па-за клеткай, ферыцыянід можа забраць гэтыя электроны назад, зноў утварыўшы сіні фарбавальнік у асяроддзі яшчэ да таго, як ён перасячэ мембрану. Пакуль ферыцыянід прысутнічаў у лішку (10 мікрамолярны фарбавальнік супраць 50–500 мікрамолярнага ферыцыяніду), паглынанне фарбавальніка амаль спынялася. Толькі пасля расходавання ферыцыяніду паглынанне аднаўлялася са звычайнай хуткасцю. Кінетыка пацвярджала тое самае іншым спосабам. Ферыцыянід знікаў з прыкладна пастаяннай хуткасцю, што адпавядала сталаму патоку аднаўлення на паверхні праз медыятар, які шматразова ўдзельнічае ў цыкле, тады як пазаклетачны фарбавальнік знікаў экспаненцыяльна па меры вычарпання яго пулу. Пастаянны паток разам з вычарпаннем пулу азначае, што сігнал ферыцыяніду адлюстроўвае бесперапыннае аднаўленне, а не выхад малекул фарбавальніка з раствору.

Другі інструмент цалкам выключаў этап перасячэння мембраны. Даследчыкі прымацавалі талуідынавы сіні O, блізкі тыязінавы аналаг, да вялікага поліакрыламіднага ланцуга, занадта вялікага, каб трапіць у клетку ў любым са станаў акіслення. Клеткі ўсё роўна аднаўлялі прымацаваны фарбавальнік. Такім чынам, аднаўленне не патрабуе доступу ўнутр клеткі. Адпаведны механізм знаходзіцца на паверхні або электрычна звязаны з ёй.

Затым адбылося раздзяленне этапаў, якое дало артыкулу назву. Цыянід і азід у канцэнтрацыі 2 мілімоляр значна прыгняталі назапашванне фарбавальніка, а пад мікраскопам цёмна-сінія і фіялетавыя ўключэнні, якія звычайна атачаюць ядро, амаль зніклі. Аднак ніводны інгібітар не запавольваў пазаклетачнае аднаўленне: цыклічныя ператварэнні ферыцыяніду працягваліся без аслаблення, а палімер, які не пранікае ў клетку, усё яшчэ аднаўляўся. Блакаванне адбывалася на пазнейшым этапе. Цыянід і азід спынялі ўнутрыклетачнае паўторнае акісленне і адасабленне фарбавальніка, а не паверхневае аднаўленне. Праверкі жыццяздольнасці пацвярджалі такую інтэрпрэтацыю: падчас гэтых уздзеянняў клеткі захоўвалі свой цытазольны маркерны фермент лактатдэгідрагеназу, таму страта паглынання не была проста вынікам атручвання або разрыву мембраны.

Адна засцярога з гэтай працы застаецца актуальнай. Сінія ўключэнні знаходзіліся вакол ядра, але не ў ім, што адпавядае акісленню ўнутры субклетачных арганэл, аднак даследаванне не вызначыла, якіх менавіта. Падобныя структуры ў іншых тыпах клетак называлі лізасомнымі на падставе слабых доказаў. Лічыце затрымліванне ўсталяваным фактам, а яго дакладнае месца — папярэдняй гіпотэзай. Чытачы, якія сочаць за далейшым шляхам электронаў, могуць перайсці да мітахандрыяльнага транспарту электронаў і акісляльна-аднаўленчых працэсаў і да шырэйшага агляду усмоктвання і размеркавання ў залежнасці ад шляху ўвядзення.

Афарбоўванне не паказвае ўздзеянне

Трэцяе даследаванне паказвае, што адбываецца, калі гэтую логіку паглынання супастаўляюць з біялагічным паказчыкам. Скот і калегі выявілі, што метыл-бэта-цыкладэкстрын, цукровая малекула ў форме кольца, непасрэдна звязвае метыленавы сіні: канстанта асацыяцыі для комплексу ўключэння складае каля 310 на моль/л супраць прыкладна 5846 на моль/л для дымерызацыі фарбавальніка. У фібрабластах L929 гэтае звязванне блакавала і афарбоўванне клетак, і стымуляцыю паглынання глюкозы: папярэдняя інкубацыя з цыкладэкстрынам прадухіляла сіняе афарбоўванне, а яго пазнейшае даданне паскарала абясколерванне. Па меры знікнення аптычнага сіняга сігналу з клетак актываваны транспарт глюкозы згасаў у цеснай адпаведнасці з ім.

Аўтары інтэрпрэтавалі гэтую карэляцыю як аргумент на карысць непасрэднага ўзаемадзеяння паміж фарбавальнікам і бялком у шляху актывацыі транспарцёра глюкозы, а не працяглага механізму акісляльнага стрэсу. Такая выснова абгрунтаваная, але мае межы. Эксперымент не вызначае бялок, не паказвае звязвання з самім транспарцёрам, а карэляцыя паміж абясколерваннем і стратай эфекту не можа выключыць усе шляхі, апасродкаваныя акісляльна-аднаўленчымі працэсамі.

Галоўны ўстойлівы ўрок датычыцца вымярэнняў. Аптычнае афарбоўванне адлюстроўвае бачны акіслены фарбавальнік, звязаны з клеткамі. Яно цалкам не ўлічвае бясколерны адноўлены пул, таму бледная клетка ўсё яшчэ можа ўтрымліваць эквіваленты фарбавальніка, а інтэнсіўна афарбаваная клетка паказвае затрыманы акіслены фарбавальнік, а не агульнае ўздзеянне на тканкі або велічыню эфекту. Гэтая ж засцярога справядлівая і ў большым маштабе: параўнанне афарбоўвання розных тыпаў клетак або ўспрыманне цёмнага зрэзу тканкі як доказу большага ўздзеяння паўтарае першапачатковую памылку назірання ў культуральнай чашцы. Паглынанне — гэта цыкл аднаўлення, дыфузіі і паўторнага акіслення, і любы адзінкавы здымак сіняй формы паказвае толькі адну яго частку. Практычныя наступствы для лабараторнага афарбоўвання і працы з фарбавальнікам і для інтэрпрэтацыі сцвярджэнняў пра дозу і ўздзеянне непасрэдна вынікаюць з гэтага.