Афарбоўка метыленавым сінім: метады мікраскапіі і атлас рэальных здымкаў

Афарбоўка метыленавым сінім дапамагае адрозніваць слабазаўважныя клетачныя структуры пры светлапольнай мікраскапіі. Яна можа дапамагчы навучэнцам знайсці ядро клеткі слізістай абалонкі шчакі або разгледзець контуры і размяшчэнне мікраарганізмаў. Аднак сіні аб’ект — гэта назіранне. Вызначыць назву арганізма, вымераць яго і вырашыць, ці сведчыць ён пра захворванне, — асобныя задачы.

Ілюстрацыя на вокладцы паказвае прынцып кантрасту. Атлас ніжэй змяшчае рэальныя фатаграфіі асобна задакументаваных узораў са звесткамі з іх першакрыніц.

Што выяўляе метыленавы сіні?

Метыленавы сіні — асноўны фарбавальнік: яго афарбаваны іон нясе дадатны зарад. Як тлумачыць OpenStax у раздзеле пра афарбоўку мікраскапічных узораў, асноўныя фарбавальнікі ўзаемадзейнічаюць з адмоўна зараджаным клетачным матэрыялам і могуць вылучаць клеткі на больш светлым фоне. У належным чынам падрыхтаваных прэпаратах метыленавы сіні падкрэслівае ўчасткі, багатыя на нуклеінавыя кіслоты, і іншыя структуры, якія звязваюць фарбавальнік.

Пры простай афарбоўцы кантраст стварае адзін фарбавальнік. Таму розныя арганізмы могуць выглядаць сінімі, не будучы адным і тым жа арганізмам. Спачатку карысна ставіць апісальныя пытанні: аб’екты круглыя ці падоўжаныя, асобныя ці сабраныя ў групы, раўнамерна афарбаваныя ці з адрознымі ўнутранымі ўчасткамі? Перш чым лічыць колер вынікам класіфікацыі, азнаёмцеся з адрозненнем паміж простай афарбоўкай і афарбоўкай паводле Грама.

Кантраст і разрознівальная здольнасць — розныя рэчы. Кантраст дапамагае адрозніць аб’ект ад яго атачэння; разрознівальная здольнасць дазваляе адрозніць блізка размешчаныя дэталі. Больш цёмны здымак не гарантуе, што на ім можна разгледзець больш структур. І не кожную цёмную гранулу варта называць арганэлай.

Натыўныя прэпараты, афарбаваныя вільготныя прэпараты і мазкі

Неафарбаваны, або натыўны, вільготны прэпарат дазваляе назіраць узор без дададзенага фарбавальніка, хоць выняцце з зыходнага асяроддзя ўсё роўна змяняе яго. У афарбаваным вільготным прэпараце рэагент дадаюць да матэрыялу, які застаецца ў вадкасці пад покрыўным шклом. Каб атрымаць фіксаваны мазок, матэрыял размяркоўваюць па прадметным шкле і перад далейшай апрацоўкай фіксуюць вызначаным метадам. Агляд падрыхтоўкі прэпаратаў ад OpenStax адрознівае вільготныя прэпараты ад фіксацыі і тлумачыць, чаму фіксаваныя арганізмы ўжо не дазваляюць назіраць нармальны рух або метабалізм.

Гэтыя прэпараты дапамагаюць адказаць на розныя пытанні:

Для параўнання на занятках спачатку зафіксуйце назіранні неафарбаванага прэпарата, а затым даследуйце асобны афарбаваны прэпарат, падрыхтаваны паводле вучэбнага пратакола. Падтрымлівайце супастаўныя ўмовы асвятлення і налады атрымання здымкаў. Калі сфатаграфаваныя дзве розныя клеткі, апісвайце іх як прыклады, а не як здымкі адной клеткі да і пасля афарбоўкі.

Мікраскапічны атлас: тры рэальныя афарбаваныя ўзоры

Гэты атлас — аўтарская падборка і інтэрпрэтацыя трох мікрафатаграфій пад адкрытымі ліцэнзіямі. Аўтары першакрыніц указваюць узоры і фарбавальнікі. Мы не праводзілі незалежнай праверкі ідэнтычнасці іх узораў. Выявы адноўленыя без кадравання шляхам пераўтварэння ў WebP без страт, без дадання дэталяў або змены колераў.

Здымак 1: клеткі слізістай абалонкі шчакі чалавека

Узор: клеткі слізістай абалонкі шчакі чалавека. Фарбавальнік: метыленавы сіні. Павелічэнне: 400×, паводле звестак фатографа. Маштабная лінейка: адсутнічае; крыніца не падае калібраванага памеру пікселя. Фатаграфія Fritzmann2002, 2017, з Клетак слізістай абалонкі шчакі чалавека (афарбоўка метыленавым сінім), пад ліцэнзіяй CC BY-SA 4.0. Гэтае ўзнаўленне захоўвае тую ж ліцэнзію.

Пачніце з асобнай клеткі: яе больш цёмнае ядро лягчэй адрозніць ад навакольнай сіняй цытаплазмы. Затым разгледзьце клеткі пад ёй, якія перакрываюцца. Перакрыцце ўскладняе прасочванне мяжы і можа ствараць лакальна больш цёмны ўчастак. Выкарыстоўвайце гэты здымак, каб практыкавацца ў прасочванні контураў, а не лічыць кожную цёмную пляму ядром. Дапаможнік па назіранні клетак слізістай абалонкі шчакі падрабязней разглядае практыкаванне з гэтым тыпам узору.

Здымак 2: клеткі цыбулі

Узор: клеткі цыбулі, як указана ў крыніцы. Фарбавальнік: метыленавы сіні. Павелічэнне: “200x” указана ў арыгінальнай назве файла; незалежна не праверана. Маштабная лінейка: адсутнічае; звестак пра каліброўку няма. Фатаграфія Alvy16, 2019, з Клеткі цыбулі 200x, пад ліцэнзіяй CC BY 4.0.

Падоўжаныя адсекі ўтвараюць упарадкаваны пласт. Параўнайце іх доўгія агульныя межы з няправільнымі контурамі на здымку 1. Таксама звярніце ўвагу на выразны цёмны матэрыял і нераўнамерную яркасць поля. Фатаграфія не дазваляе вызначыць прыроду кожнага цёмнага адкладу. Яна паказвае, чаму карысны запіс назіранняў уключае артэфакты і нявызначанасць, а не прысвойвае назвы ўсяму, што афарбоўваецца.

Здымак 3: дрожджы, пазначаныя ў крыніцы як Candida spp.

Узор: Candida spp., паводле звестак фатографа. Афарбоўка: простая пазітыўная афарбоўка метыленавым сінім. Павелічэнне: звесткі адсутнічаюць. Маштабная лінейка: адсутнічае; калібраваны памер пікселя не пададзены. Фатаграфія Marta, карыстальніцы Wikimedia Martunia.g, 2021, з Пазітыўнай афарбоўкі метыленавым сінім 2, пад ліцэнзіяй CC BY 4.0.

Параўнайце шчыльныя сінія групы з менш запоўненымі краявымі ўчасткамі. Асобныя контуры лягчэй прасачыць там, дзе аб’екты менш перакрываюцца. Назва Candida паходзіць з апісання ў крыніцы, а не з відавой ідэнтыфікацыі, выкананай паводле гэтай фатаграфіі. Гэты здымак таксама не дае выніку ацэнкі жыццяздольнасці. Аналізы жыццяздольнасці і дыхання дрожджаў патрабуюць уласных умоў, кантроляў і інтэрпрэтацыі.

Як правільна разумець маштаб

Гэтыя здымкі прыдатныя для візуальнага параўнання, але не для вымярэнняў у мікраметрах або параўнання абсалютных памераў клетак паміж здымкамі. Указанае павелічэнне не дазваляе аднавіць адсутную каліброўку камеры. Змена памеру выявы на экране змяняе яе ўяўнае павелічэнне.

Для ўласных здымкаў выканайце вымяральную каліброўку з дапамогай вядомага эталона і адпаведнай аптычнай канфігурацыі. Дапаможнік Nikon па мікраметрыі тлумачыць, як аб’ект-мікрометр пераводзіць умоўныя дзяленні выявы або вымяральнай сеткі ў фізічныя даўжыні. Запішыце аб’ектыў, канфігурацыю камеры і каліброўку, а затым дадайце маштабную лінейку на падставе гэтых даных. Не вызначайце яе паводле сярэдняга памеру клеткі з падручніка.

Ці адпавядае змесціва флакона метаду?

Флакон з надпісам «метыленавы сіні» — не поўная лабараторная спецыфікацыя. Праверце канцэнтрацыю і адзінкі яе вымярэння, растваральнік, дадатковыя інгрэдыенты, прызначэнне, дакументацыю партыі і інструкцыі. Пашпарт бяспекі рэагенту апісвае небяспекі; інструкцыі да метаду вызначаюць, як выкарыстоўваць яго для патрэбнага прэпарата.

Канкрэтны прыклад — раствор метыленавага сіняга Лёфлера ад Merck. Вытворца пазначае яго як рэагент для мікраскапіі і апісвае яго ролю як кантрастнага фарбавальніка пры афарбоўцы на кіслотаўстойлівасць. Указаная вогненебяспечнасць таксама паказвае, чаму звестак «сіняя вадкасць» недастаткова для планавання працы з ёй або награвання. Гэтыя ўласцівасці датычацца менавіта гэтага складу, а не аўтаматычна кожнага воднага раствору метыленавага сіняга.

Аналагічна, эазін-метыленавы сіні агар — пажыўнае асяроддзе з вызначаным складам. Гэта не фарбавальнік для прэпаратаў на прадметным шкле, які атрымліваюць, дадаючы да ўзору толькі метыленавы сіні. Для іншай мэты візуалізацыі параўнайце альтэрнатывы метыленаваму сіняму для мікраскапіі.

Калі вы карыстаецеся наборам для пачаткоўцаў з мікраскопам, пачніце з яго задакументаванай вучэбнай методыкі, гатовых прэпаратаў з вядомым змесцівам і ўказанага рэагенту. Калі флакон страціў этыкетку або яго склад немагчыма ўстанавіць, замяніце яго адпаведным рэагентам з дакументацыяй. Выкарыстоўвайце сродкі абароны вачэй і выконвайце інструкцыі па абыходжанні менавіта з гэтым складам. Для матэрыялу чалавека і невядомых узораў з навакольнага асяроддзя неабходна выконваць працэдуры вучэбнай лабараторыі па абыходжанні з узорамі і іх утылізацыі; афарбоўка не замяняе гэтыя працэдуры.

Запішыце назіранне перад высновай

«Сінія авальныя аб’екты ў групах» — абгрунтаванае апісанне выявы. «Канкрэтная інфекцыя» патрабуе доказаў, якіх выява не дае. У лабараторным журнале асобна запісвайце паходжанне ўзору, падрыхтоўку прэпарата, рэакцыю афарбоўвання і метад ідэнтыфікацыі. Такое размежаванне робіць просты вучэбны здымак карысным і не дазваляе прывабнай мікрафатаграфіі служыць падставай для сцвярджэння, якое яна не можа пацвердзіць.